發(fā)布時(shí)間：2021-10-09 17:29

　　基因定點(diǎn)編輯技術(shù)為植物功能基因研究和作物遺傳育種提供了重要的技術(shù)支撐。CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)作為當(dāng)前最熱門的基因編輯技術(shù),其作用原理主要由sgRNA靶向目的DNA序列并與之結(jié)合,從而激活Cas9的核酸酶切割靶DNA,產(chǎn)生靶序列DNA雙鏈斷裂（DSB）的損傷。通過非同源末端連接與同源重組的修復(fù)方式在靶位點(diǎn)處產(chǎn)生DNA片段的插入或缺失或在靶位點(diǎn)處敲入外源片段或引入點(diǎn)突變,以此來實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的突變。另外,在DNA修復(fù)機(jī)制中,同源重組的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于非同源末端連接,導(dǎo)致靶位點(diǎn)處修復(fù)結(jié)果不可控。而單堿基編輯技術(shù)在不依賴雙鏈斷裂的條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因片段中特定位點(diǎn)的單個(gè)堿基進(jìn)行轉(zhuǎn)換,可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的精確修飾。目前已開發(fā)出實(shí)現(xiàn)靶序列中C/G→T/A轉(zhuǎn)換的CBE編輯器和A/T→G/C轉(zhuǎn)換的ABE編輯器,這些單堿基編輯器針對(duì)目標(biāo)基因的修飾可以不再依賴于DNA雙鏈斷裂且能產(chǎn)生4種形式的堿基轉(zhuǎn)換,既規(guī)避了HR修復(fù)途徑效率低的限制,也擺脫了NHEJ修復(fù)途徑的隨機(jī)性。植物的成花過程受外部環(huán)境的影響與錯(cuò)綜復(fù)雜的內(nèi)源基因調(diào)控。FT、CO調(diào)控植物開花進(jìn)程,突變FT、CO基因使其在植物體內(nèi)的表達(dá)量降低或不... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

TALEN作用原理示意圖（沈延等，2013）

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文4圖1-2CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用原理示意圖（Wiedenheftetal.，2012）Figure1-2SchematicdiagramofCRISPR/Cas9systemprinciple(Wiedenheftetal.,2012)1.1.3.2CRISPR/Cas介導(dǎo)的多基因編輯CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物體細(xì)胞內(nèi)工作時(shí)每個(gè)sgRNA都具有獨(dú)立性，這使其在同一個(gè)體實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)或多基因的編輯成為可能。CRISPR/Cas系統(tǒng)主要由sgRNA與Cas9蛋白組成，sgRNA識(shí)別并導(dǎo)向Cas9蛋白對(duì)靶位點(diǎn)的切割，因此，CRISPR/Cas系統(tǒng)的靶向精確性很大程度上取決于sgRNA生成。研究發(fā)現(xiàn)tRNA大量存在于生物體細(xì)胞內(nèi)，能在細(xì)胞內(nèi)迅速加工合成，其合成機(jī)制與生物體自身的單個(gè)多順反子基因合成的小片段RNA的機(jī)制非常相似（Nakajimaetal.，1981；Kruszkaetal.，2014）。BoxA和BoxB作為tRNA內(nèi)部啟動(dòng)原件能招募RNA聚合酶PolⅢ型復(fù)合體，此外，RNA聚合酶PolⅢ型啟動(dòng)子的表達(dá)也能在tRNA序列的作用下加強(qiáng)（Diecietal.，2007；Whiteetal.，2011）�；谝陨显�，研究者將tRNA與gRNA進(jìn)行結(jié)合，一種能夠同時(shí)產(chǎn)生大量gRNA的多順反子結(jié)構(gòu)tRNA-gRNA的創(chuàng)制得以實(shí)現(xiàn)（Xieetal.，2015）。CRISPR/Cas9表達(dá)載體中tRNA組分被內(nèi)源tRNA加工系統(tǒng)識(shí)別并將gRNA從tRNA-gRNA轉(zhuǎn)錄物中切除出形成單個(gè)獨(dú)立的gRNA，細(xì)胞內(nèi)大量存在的gRNA引導(dǎo)Cas9靶向多個(gè)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行基因組編輯。此外，Ma等應(yīng)用PCR程序原理使多個(gè)表達(dá)盒sgRNA能夠快速的得到，由Gibson或GoldenGate構(gòu)建二元表達(dá)載體，再與經(jīng)過優(yōu)化的Cas9蛋白結(jié)合，實(shí)

第1章文獻(xiàn)綜述5現(xiàn)了在雙子葉和單子葉植物中的多基因編輯，這大大提高了突變效率。圖1-3基于內(nèi)源tRNA表達(dá)加工的CRISPR/Cas9多基因編輯原理圖（Xieetal.，2015）Figure1-3SchematicdiagramofCRISPR/Cas9multigeneeditingbasedonendogenoustRNAexpressionprocessing(Xieetal.,2015)1.1.3.3CRISPR/Cas9技術(shù)在作物中的應(yīng)用自然進(jìn)化過程中基因突變是生物多樣性的重要來源，在作物育種中基因突變也為優(yōu)良品種的選育提供了更多的選擇。盡管物理誘變（如γ射線）和化學(xué)誘變（如亞硝基乙基脲NEH和甲基磺酸乙酯EMS）的方法能引入植物基因的突變，但此種方法引入的基因突變具有隨機(jī)性而且難以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的定向突變，在作物育種方面難以廣泛應(yīng)用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)目的基因的精準(zhǔn)打靶完成定向突變，此系統(tǒng)至開發(fā)以來即被育種家們廣泛應(yīng)用于作物育種，迅速成為了作物遺傳育種中的熱門技術(shù)。在水稻中Gn1a、DEP1、GS3、IPA1分別控制水稻穗粒數(shù)、直立密穗、單粒重和分蘗數(shù)，Li等利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)這上述基因進(jìn)行突變，成功創(chuàng)制了優(yōu)良性狀的水稻品種，大幅度的提高了產(chǎn)量（Lietal.,2016）。此外，利用此系統(tǒng)進(jìn)行水稻抗病基因與抗除草劑基因的編輯，獲得了抗稻瘟病和抗除草劑的水稻品種（Liuetal.,2012；Sunetal.,2016）。在玉米育種中，育種家一直探索著降低玉米中的肌醇六磷酸（PA），因?yàn)檫@類物質(zhì)對(duì)于單胃動(dòng)物來說難以吸收消化。ZmIPK1A、ZmIPK、ZmMRP基因控制著PA合成途徑，Liang等應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)成功敲除ZmIPK基因，大幅度降低了玉米中的PA含量（Liangetal.,2014）。另外，CRISPR/Cas9技術(shù)也被用于玉米代謝途徑調(diào)控（Fengetal.,2016）、鹽脅迫（Xingetal.,2014）和干旱脅迫（Habbenetal.,2014；Shietal.,2016）等基因編輯。


本文編號(hào)：3426751