發(fā)布時間：2021-10-09 04:47

　　木材是工業(yè)和生物質(zhì)能源等生產(chǎn)的被廣泛使用的可再生原料。林木次生木質(zhì)部不僅木質(zhì)化形成木材,同時負(fù)責(zé)將根吸收的水分及離子運輸?shù)狡渌M織,其發(fā)育和建成對林木適應(yīng)干旱環(huán)境尤為重要。因此,通過對木質(zhì)部響應(yīng)干旱脅迫的研究,既可以了解更多有關(guān)抗旱的機制,也可以了解干旱脅迫對生產(chǎn)木質(zhì)生物質(zhì)的影響。MYB家族轉(zhuǎn)錄因子不僅在木材形成中發(fā)揮著關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,而且在植物響應(yīng)干旱脅迫中起著重要的調(diào)控作用。本實驗室前期研究結(jié)果顯示PtrMYB92基因在毛果楊木質(zhì)部中特異表達(dá),并且受干旱脅迫調(diào)控,預(yù)示著PtrMYB92基因可能參與調(diào)控毛果楊木質(zhì)部發(fā)育以及干旱脅迫響應(yīng)過程。本研究首先通過農(nóng)桿菌浸染的快速遺傳轉(zhuǎn)化法將PtrMYB92基因過表達(dá)載體和CRISPR突變載體對毛果楊進行遺傳轉(zhuǎn)化,并對轉(zhuǎn)基因植株進行DNA、RNA水平分子檢測及測序鑒定,最終獲得了 13個過表達(dá)PtrMYB92轉(zhuǎn)基因株系和4個敲除PtrMYB92基因的突變體株系。通過觀察這些轉(zhuǎn)基因和突變體植株的表型發(fā)現(xiàn),與野生型毛果楊相比,過表達(dá)PtrMYB92轉(zhuǎn)基因植株的根系少、莖干細(xì)、葉片小、植株矮,而PtrMYB92基因突變體植株在形態(tài)上與野生型沒有明... 

【文章來源】：東北林業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１技術(shù)路線??注：虛線部分為實驗室前期實驗結(jié)果??

－ＲＴ－Ｆ?（５?＾Ｍ）?０．６?ｐｉ??Ａｃｔｉｎ－Ｒ／Ｔ－ＰｆｒＭＹＢ９２－ＲＴ－Ｒ?Ｃ５?＾Ｍ）?０．６?ｐｉ??反應(yīng)條件：??９５°Ｃ預(yù)變性ｌＯｍｉｎ；?９５°Ｃ變性３０?ｓ；?５５°Ｃ退火３０ｓ；?６８°Ｃ延伸ｌｍｉｎ；共擴增４０個循??環(huán)，６８°Ｃ再延伸３０ｍｉｎ；?４°Ｃ保存。??２．３結(jié)果與分析??２．３．１?的表達(dá)特異性和生物信息學(xué)分析??通過本實驗室前期的實驗研究收集毛果楊的不同組織水平部位：頂芽、葉片、木質(zhì)??部和韌皮部，進行ＲＮＡ－ｓｅｑ，數(shù)據(jù)分析如圖２－１顯示ＰｏＭ．如７容／從汾Ｗ?基??因的表達(dá)情況是其在木質(zhì)部的相對表達(dá)量為４０多，而在頂芽、葉片、韌皮部的表達(dá)水??平極其低不超過１，因而是木質(zhì)部特異表達(dá)基因。??５０????ｆ—１?Ｐｔｒ＼（ＹＢ９２??４０?－?ｒ＾＾＞ｉ??＊３０．??蛘２０．??友??班?１〇，?＿??會．??〇Ｊ?＊■■■■?Ｉ—??．?＇?ｉ?????ｘｙｌｅｍ?ｐｈｌｏｅｍ?ｌｅａｆ?ｓｈｏｏｔ??圖２－１尸基因特異性表達(dá)分析??之后使用ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫當(dāng)中的ＯＲＦ?Ｆｉｎｄｅｒ程序，對ＰｏｆｒＷＷｇＡ？撻則２）??基因的開放讀碼框進行繪制，并用ＢｉｏＥｄｉｔ軟件將基因翻譯成下面的蛋白序列：??－１２－??

東北林業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文??纖匪??圖２－２過表達(dá)毛果楊的獲得??２．３．２．２?Ｐ／ｒＭＹ５９２過表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛果楊的ＤＮＡ水平檢測??當(dāng)有抗性的小苗生長到約５?ｃｍ時，剪取其第２片葉子提�。模危粒⑶沂褂茫穑拢桑保玻�??載體上的３５Ｓ啟動子區(qū)域的片段當(dāng)做檢測ＤＮＡ的上游引物，取基因的中間一段２０ｂｐ長??度的特異性序列為下游引物，總長度約５００ｂｐ，對提取的毛果楊葉片ＤＮＡ進行ＰＣＲ擴??增檢測。在檢測時分別使用同種引物對過表達(dá)重組質(zhì)粒、提取的野生型ＤＮＡ??以及水進行ＰＣＲ擴增，過表達(dá)重組質(zhì)粒的擴增產(chǎn)物作陽性對照，野生型??ＤＮＡ、水的ＰＣＲ擴增產(chǎn)物作陰性對照。對獲得的ＰＣＲ產(chǎn)物進行１％瓊脂凝膠電泳實??驗。電泳結(jié)果如圖２－３所示。說明過表達(dá)重組質(zhì)粒成功整合到了毛果楊基因??組當(dāng)中。?Ｍ?１?２?３?４?５?６??２〇〇〇ｂｐ?—??ｉ〇〇〇ｂｐ??５〇〇ｂＰ?■■■??圖２－３轉(zhuǎn)基因毛果楊ＤＮＡ水平檢測??注：圖中Ｍ：?ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬｌＯＯＯ；?１：?３５Ｓ：／ＶＭｒａ９２質(zhì)粒作陽性對照；２－４：待測植株的??ＤＮＡ；?５：野生型毛果楊的ＤＮＡ；?６：水??２．３．２．３竹ｒＭｒ５５＞２過表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛果楊的ＲＮＡ水平檢測??對ＤＮＡ檢測有條帶的抗性植株，再剪取其第３片葉子進行ＲＮＡ的提取，然后將??其反轉(zhuǎn)錄合成ｃＤＮＡ，并以ｃＤＮＡ作為模板，毛果楊ＰｔｒＡｃｔｉｎ７基因??（Ｐｏｔｒｉ．０１９Ｇ０１０４００）作對照，進行實時熒光定量ＰＣＲ檢測基因的表達(dá)量，對定量結(jié)果??進行數(shù)據(jù)分析［７４］。在轉(zhuǎn)基因株系中基因的表達(dá)水平，檢測結(jié)果如圖２－４所示，共有１３??個株系在ＲＮＡ水平檢測到不同程度

【參考文獻】：
期刊論文
[1]MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆脅迫中的作用及其分子機理[J]. 劉蕾,杜海,唐曉鳳,吳燕民,黃玉碧,唐益雄.  遺傳. 2008(10)



本文編號：3425662