第一部分基于擴(kuò)增子高通量半導(dǎo)體測序技術(shù)的肺纖維化基因診斷方法的建立研究目的:特發(fā)性肺纖維化是一類病因不明確的進(jìn)展性肺間質(zhì)性疾病,缺乏有效的早期診斷手段,確診后往往預(yù)后不良。因此,探明其復(fù)雜的分子遺傳學(xué)的發(fā)病機(jī)制,建立基于擴(kuò)增子高通量半導(dǎo)體測序的肺纖維化相關(guān)致病基因診斷方法能幫助臨床醫(yī)師指導(dǎo)個(gè)體化治療,實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。研究方法:設(shè)計(jì)了一個(gè)肺纖維化基因包,其包括有SFTPC,SFTPA1,SFTPA2,MUC5B,TERC,TERT,RTEL1,PARN,ELMOD2等92個(gè)基因,對(duì)臨床診斷為特發(fā)性肺纖維化的25個(gè)患者進(jìn)行基于Ion Torrent平臺(tái)的高通量擴(kuò)增子半導(dǎo)體測序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:使用設(shè)計(jì)的肺纖維化基因包對(duì)25個(gè)散發(fā)特發(fā)性肺纖維化患者進(jìn)行高通量測序,平均每個(gè)樣本在覆蓋的92個(gè)目標(biāo)基因的測序中,得到了15G,98.4%的平均覆蓋度,共95762858比對(duì)成功的讀取序列,71.6%的可用序列,157bp的平均讀長,平均1320乘的測序深度以及81.44%的均一性。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:我們首次使用Ion Torrent高通量測序平臺(tái)的擴(kuò)增子技術(shù),為肺纖維化患者提供了一個(gè)快捷準(zhǔn)確可靠,高性價(jià)比的基因診斷... 

【文章來源】：華中科技大學(xué)湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

IPF基于HRCT和病理的診斷模式

基因包的設(shè)計(jì):1.按照關(guān)鍵詞肺纖維化(pulmonary fibrosis),肺間質(zhì)性病變(Interstitial lung Disease)搜索專業(yè)基因檢測網(wǎng)站,找到已被報(bào)道認(rèn)可的肺纖維化的致病基因,人類孟德爾遺傳網(wǎng)(OMIM,Online Mendelian Inheritance in Man,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/),人類基因突變網(wǎng)(HGMD,Human Gene Mutation Database,http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php),基因檢測注冊(cè)網(wǎng)(GTR,Genetic Testing Registry,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/)。2.文獻(xiàn)搜索,在pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)上分別用肺纖維化(pulmonary fibrosis)和肺間質(zhì)性病變(Interstitial lung Disease)分別用“和(and)”加上下列關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索致病(causal)、家族聚集性(familial)、基因(gene or genetic)、全基因組關(guān)聯(lián)性研究(GWAS,Genome-Wide Association Studies)統(tǒng)計(jì)了2000年1月到2015年3月的所有文獻(xiàn),對(duì)文獻(xiàn)涉及到的基因進(jìn)行歸納總結(jié)。3.搜索老鼠基因網(wǎng)(MGD,Mouse Genome Database http://www.informatics.jax.org/)搜索表現(xiàn)為肺纖維化的相關(guān)基因工程老鼠的對(duì)應(yīng)基因。使用Phenolyzer(http://phenolyzer.wglab.org/)對(duì)這些基因進(jìn)行進(jìn)一步分析,這些基因的關(guān)系見下圖1.2。肺纖維化的基因包(panel)包含了92個(gè)相關(guān)基因的全部編碼區(qū)和臨近的調(diào)控區(qū)域使用Ion Ampli Seq?公司的客戶自定義基因平臺(tái)進(jìn)行自定義設(shè)計(jì),基因的覆蓋度見表1.1。這些引物合成后一共1451個(gè)擴(kuò)增子(amplicon)被分到兩個(gè)混合反應(yīng)中,對(duì)基因包對(duì)于覆蓋不全的基因,已整理出來表1.2進(jìn)行引物設(shè)計(jì),使用Sanger法進(jìn)行一代測序,完善基因的覆蓋度,同時(shí)也對(duì)MUC5B的rs35705950位點(diǎn)專門設(shè)計(jì)一代引物進(jìn)行測序。

1 芯片測序質(zhì)量和覆蓋度1.1 芯片測序總質(zhì)量使用測序采用PI芯片,對(duì)25個(gè)臨床診斷的IPF患者進(jìn)行測序,總共得到15G的數(shù)據(jù),信號(hào)Key Signal為66,ISP loading為92%,代表本次上機(jī)測序正常,在整個(gè)芯片中,共有92%的微孔中,有ISP陽性的珠子,其中有活性的珠子為100%。測序得的總讀數(shù)為95,762,858條,可用的讀數(shù)為71%,中位測序讀長為151bp,平均測序讀長為157bp,多克隆珠子為24%。


本文編號(hào)：3417941