多能干細胞多能性的退出及功能細胞/組織的獲得作為現(xiàn)階段干細胞與再生醫(yī)學領(lǐng)域的兩個核心問題,是決定干細胞與再生醫(yī)學研究能否向臨床轉(zhuǎn)化的第一道關(guān)卡。目前,干細胞多能性的維持方面的研究已經(jīng)相當成熟,然而對其如何從不斷地自我更新和增殖的多能性穩(wěn)態(tài)中退出,乃至分化成特定譜系的特異性細胞或者組織的相關(guān)的機理卻知之甚少,盡管目前已知的內(nèi)源性因子Tcf711、Tfe3以及NuRD復合物等在多能性退出中發(fā)揮了重要作用,但是其他促進多能干細胞退出多能性基態(tài)的基因還有待確定,為此,我們將CRISPR/Cas9全基因組基因敲除這種全新的技術(shù)應用于此,首次在基因組層面以一種無偏的方式篩選促進多能性退出的關(guān)鍵基因。本項研究成功建立了基于CRISPR/Cas9全基因組基因敲除篩選多能性退出關(guān)鍵基因模型,利用慢病毒轉(zhuǎn)染/感染技術(shù)、lenti-Cas9基因敲除技術(shù)、shRNA基因敲降技術(shù),通過PCR重測序、MAGeCK分析（Model-based Analysis of Genome-wide CRISPR-Cas9 Knockout）、GO 分析等數(shù)據(jù)獲取及處理方法,初步發(fā)現(xiàn)了 Epc1以及Fbxw7具有促進小鼠胚胎... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學廣東省

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－４篩選模型簡易模式圖首先在２ｉ／ｌｉｆ條件下將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入０Ｇ２小鼠胚胎干細胞，抗??性篩選后分化，分化數(shù)代，恢復２ｉ／ｌｉｆ培養(yǎng)條件，將存活下來的細胞擴起來，收樣作為實驗??

?第一章全基因組基因敲除篩選多能性退出關(guān)鍵基因模型的建立???圖１－５分化模型三階段ｍＥＳＣｓ細胞圖與（Ｆｉｇ．?１－４）相對應，包括明場及熒光。??Ｆｉｇ?１－５?ｐｈｏｔｏｓ?ｏｆ?ｍＥＳ?ｃｅｌｌｓ?ａｔ?ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ?ｔａｇｅ?ｏｆ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｍｏｄｅｌ．?Ｉｍａｇｅｓ?ｏｆ?ｍＥＳ?ｃｅｌｌｓ?ａｔ??ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ?ｓｔａｇｅ?ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ?ｔｏ?（?Ｆｉｇ．?１－４?）?，ｂｏｔｌｉ?ｐｈａｓｅ?ａｎｄ?Ｏｃｔ－ＧＦＰ??３．３?如上所述，向Ｃａｓ９－ＥＳ細胞中轉(zhuǎn)入已經(jīng)擴增好的ＧｅＣＫＯｖ２．０質(zhì)粒，分化??兩代后，恢復２ｉ／ｌｉｆ終止分化，培養(yǎng)一代后收樣提取基因組ＤＮＡ，進行ＰＣＲ重??測序，然后使用ＭＡＧｅＣＫ算法多測序結(jié)果進行整理；對韻整理出的結(jié)果，－??方面，可以用于評價該模型是否已將生效，另一方面，如果模型已經(jīng)生效，則??進一步對實驗組進行分析，獲得我們的目的基因。然后通過兩輪實驗驗證，確??定目的基因，再進一步研究其機制。??①?——①①。??ｖ－???Ｃａｓ９－Ｂｌａｓｔ???ＧｅＣＫＯ－Ｌｉｂｒａｒｙ?＾?????ＷＴ?０Ｇ２ＥＳ?ＯＧ２ＥＳ－Ｃａｓ９?ＯＧ２ＥＳ－Ｃａｓ９??－ＧｅＣＫＯ??２?Ｐａｓｓａｇｅｓ?３?Ｐａｓｓａｇｅｓ??▼??ｃ—?＾?２ｉ／Ｌｉｆ?ｃｒ￣?２ｉＡＪｆ?ｆｒｅｅ?＾?＾????Ｉｎｐｕｔ?２??ＭＡＧｅＣＫ?Ｐａｓｓａｇｅｓ?Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ??▼??Ｇｅｎｅｓ?Ｒａｎｋｉｎｇ?羞?▲美??－．?！??①①?Ｑ?ｃａｎｄ，ｄａｔｅｓ??Ｇｅｎ

；???１．２Ｅ７?傳代??１．２Ｅ７?傳代?？（?Ｉ?Ｉ?１??１?｜?１?＼?１１??１．２Ｅ７?傳代一＿??（＋２ｉ／ｌｉｆ）?ｉ??ｉ￣￣ｉ￣ｉ￣ｉ￣�。椋椋椋椋椋椋椋椋椋椋桑椋�??ＤＯ?Ｄ２?Ｄ４?Ｄ６?Ｄ８?ＤＩＯ?０１２?Ｄ１４?Ｄ１６?Ｄ１８?Ｄ２０??ｉ?（?Ｉ??收ｉｎｐｕｔｌ?收ｉｎｐｕｔ２?實驗絕Ｐ３??圖１－７實驗流程圖圖中顯示了實驗的詳細技術(shù)路線??Ｆｉｇ．?１－７?Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ?ｒｏｕｔｅ２．４Ｅ７?ｌｃｎｔｉＣａｓ９－Ｂｌａｓｔ－ｃｘｐｒｃｓｓｉｎｇ?ｍＥＳ?ｗｅｒｅ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ??ＧｅＣＫＯ（ｖ２）ｌｅｎ（ｉＧｕｉｄｃ－Ｐｕｒｏ?ｉｎ?２ｉ?ａｎｄ?（ｈｅｎ?ｎｉａｋｃ?ａ?ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｉｎｐｕｔｌ?＾ｆｔｅｒ?４８?ｌｉｒ?ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ??ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｉｎｐｕｔ２?ｆｏｒ?ｍｏｒｅ?３?ｐａｓｓａｇｅｓ?（９?ｄａｙｓ）?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ｉｎ?Ｎ２Ｂ２７＋２ｉ／ＬＩＦ；ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ?ｇｒｏｕｐ??ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ?ａｆｔｅｒ?２?ｐａｓｓａｇｅｓ?ｏｆ?ｍｕｔａｔｉｏｎ?ｐｅｒｉｏｄ?ａｎｄ?２?ｐａｓｓａｇｅｓ?ｏｆ?２ｉ?ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ?ａｎｄ?ｏｎｅ?ｍｏｒｅ??ｐａｓｓａｇｅ?ｉｎ?２ｉ?ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ?（２．４Ｅ７?ｓｔａｎｄｓ?ｆｏｒ?２．４＼１０７?ｍＥＳ?ｃｅｌｌｓ）??４小結(jié)??本階段的目標之一是確定分化的時間窗口（各步處理的時間


本文編號：3395098