多能干細(xì)胞多能性的退出及功能細(xì)胞/組織的獲得作為現(xiàn)階段干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的兩個(gè)核心問(wèn)題,是決定干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究能否向臨床轉(zhuǎn)化的第一道關(guān)卡。目前,干細(xì)胞多能性的維持方面的研究已經(jīng)相當(dāng)成熟,然而對(duì)其如何從不斷地自我更新和增殖的多能性穩(wěn)態(tài)中退出,乃至分化成特定譜系的特異性細(xì)胞或者組織的相關(guān)的機(jī)理卻知之甚少,盡管目前已知的內(nèi)源性因子Tcf711、Tfe3以及NuRD復(fù)合物等在多能性退出中發(fā)揮了重要作用,但是其他促進(jìn)多能干細(xì)胞退出多能性基態(tài)的基因還有待確定,為此,我們將CRISPR/Cas9全基因組基因敲除這種全新的技術(shù)應(yīng)用于此,首次在基因組層面以一種無(wú)偏的方式篩選促進(jìn)多能性退出的關(guān)鍵基因。本項(xiàng)研究成功建立了基于CRISPR/Cas9全基因組基因敲除篩選多能性退出關(guān)鍵基因模型,利用慢病毒轉(zhuǎn)染/感染技術(shù)、lenti-Cas9基因敲除技術(shù)、shRNA基因敲降技術(shù),通過(guò)PCR重測(cè)序、MAGeCK分析（Model-based Analysis of Genome-wide CRISPR-Cas9 Knockout）、GO 分析等數(shù)據(jù)獲取及處理方法,初步發(fā)現(xiàn)了 Epc1以及Fbxw7具有促進(jìn)小鼠胚胎... 

【文章來(lái)源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁(yè)數(shù)】：86 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－４篩選模型簡(jiǎn)易模式圖首先在２ｉ／ｌｉｆ條件下將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入０Ｇ２小鼠胚胎干細(xì)胞，抗??性篩選后分化，分化數(shù)代，恢復(fù)２ｉ／ｌｉｆ培養(yǎng)條件，將存活下來(lái)的細(xì)胞擴(kuò)起來(lái)，收樣作為實(shí)驗(yàn)??

?第一章全基因組基因敲除篩選多能性退出關(guān)鍵基因模型的建立???圖１－５分化模型三階段ｍＥＳＣｓ細(xì)胞圖與（Ｆｉｇ．?１－４）相對(duì)應(yīng)，包括明場(chǎng)及熒光。??Ｆｉｇ?１－５?ｐｈｏｔｏｓ?ｏｆ?ｍＥＳ?ｃｅｌｌｓ?ａｔ?ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ?ｔａｇｅ?ｏｆ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｍｏｄｅｌ．?Ｉｍａｇｅｓ?ｏｆ?ｍＥＳ?ｃｅｌｌｓ?ａｔ??ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ?ｓｔａｇｅ?ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ?ｔｏ?（?Ｆｉｇ．?１－４?）?，ｂｏｔｌｉ?ｐｈａｓｅ?ａｎｄ?Ｏｃｔ－ＧＦＰ??３．３?如上所述，向Ｃａｓ９－ＥＳ細(xì)胞中轉(zhuǎn)入已經(jīng)擴(kuò)增好的ＧｅＣＫＯｖ２．０質(zhì)粒，分化??兩代后，恢復(fù)２ｉ／ｌｉｆ終止分化，培養(yǎng)一代后收樣提取基因組ＤＮＡ，進(jìn)行ＰＣＲ重??測(cè)序，然后使用ＭＡＧｅＣＫ算法多測(cè)序結(jié)果進(jìn)行整理；對(duì)韻整理出的結(jié)果，－??方面，可以用于評(píng)價(jià)該模型是否已將生效，另一方面，如果模型已經(jīng)生效，則??進(jìn)一步對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行分析，獲得我們的目的基因。然后通過(guò)兩輪實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確??定目的基因，再進(jìn)一步研究其機(jī)制。??①?——①①。??ｖ－???Ｃａｓ９－Ｂｌａｓｔ???ＧｅＣＫＯ－Ｌｉｂｒａｒｙ?＾?????ＷＴ?０Ｇ２ＥＳ?ＯＧ２ＥＳ－Ｃａｓ９?ＯＧ２ＥＳ－Ｃａｓ９??－ＧｅＣＫＯ??２?Ｐａｓｓａｇｅｓ?３?Ｐａｓｓａｇｅｓ??▼??ｃ—?＾?２ｉ／Ｌｉｆ?ｃｒ￣?２ｉＡＪｆ?ｆｒｅｅ?＾?＾????Ｉｎｐｕｔ?２??ＭＡＧｅＣＫ?Ｐａｓｓａｇｅｓ?Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ??▼??Ｇｅｎｅｓ?Ｒａｎｋｉｎｇ?羞?▲美??－．?！??①①?Ｑ?ｃａｎｄ，ｄａｔｅｓ??Ｇｅｎ

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本文編號(hào)：3395098