丹參（Salvia miltiorrhiza）為唇形科鼠尾草屬多年生雙子葉植物,其干燥根及根莖是我國傳統(tǒng)中藥材之一,CRISPR/Cas9為一種新型定點(diǎn)基因編輯技術(shù)。本研究基于CRISPR/Cas9技術(shù),以酚酸類成分含量較高的山農(nóng)丹參1號為材料,確定在該技術(shù)中應(yīng)用較多的篩選劑潮霉素的篩選濃度以及適合丹參的除菌抗生素的種類和濃度。采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計從超聲波預(yù)處理時間、乙酰丁香酮濃度、侵染濃度、侵染時間四個因素進(jìn)行探索,對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化,然后以丹參酚酸合成途徑中的關(guān)鍵酶基因SmPAL1為目標(biāo)基因?qū)ζ溥M(jìn)行編輯。對SmPAL1基因的靶位點(diǎn)進(jìn)行體外靶點(diǎn)效率檢測并構(gòu)建CRISPR/Cas9載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建好的VK005-03表達(dá)載體轉(zhuǎn)入丹參受體材料山農(nóng)丹參1號中,獲得了新的轉(zhuǎn)基因植株。主要結(jié)果如下:1、通過對丹參愈傷組織誘導(dǎo)優(yōu)化,潮霉素濃度的篩選,除菌抗生素的篩選以及超聲波預(yù)處理時間、侵染濃度、乙酰丁香酮濃度、侵染時間四個因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),獲得了一套穩(wěn)定高效的丹參遺傳轉(zhuǎn)化體系。2、設(shè)計了3個CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)（SmPAL... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

丹參無菌苗Fig.1AsepticseedlingofSalviamiltiorrhiza

濃度Concentration/mg·LCallus rate/% 平均值重復(fù)ⅠAverage value/%Repeat Ⅰ重復(fù)ⅡRepeat Ⅱ重復(fù)ⅢRepeat Ⅲ0.01 87.6 87.9 88.2 87.9d0.02 88.7 87.4 88.2 88.1d0.03 92.4 92.6 93.7 92.9c0.04 95.6 96.3 95.2 95.7b0.05 100.0 100.0 100.0 100.0a當(dāng)培養(yǎng)基中只添加 6-BA 時，丹參出愈率隨著 6-BA 濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下勢，濃度為 3 mg/L 時，出愈率最高，顯著高于其他濃度處理，選擇 6-BA 濃度為g/L。當(dāng)培養(yǎng)基中只添加 NAA 時，濃度為 0.2 mg/L 丹參出愈率最高，顯著高于其處理，且葉片能夠全部分化出綠色愈傷組織（圖 2）。當(dāng)培養(yǎng)基中只添加 2, 4-D 時為 0.05 mg/L 丹參出愈率達(dá)到了 100.0%，葉片分化出綠色愈傷組織且質(zhì)地緊密（根據(jù)以上結(jié)果選擇在MS培養(yǎng)基中添加3 mg/L的6-BA、0.2 mg/L的NAA和0.05mg2, 4-D 為誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基。

濃度為 0.05 mg/L 丹參出愈率達(dá)到了 100.0%，葉片分化出綠色愈傷組織且質(zhì)地緊密（圖3）。根據(jù)以上結(jié)果選擇在MS培養(yǎng)基中添加3 mg/L的6-BA、0.2 mg/L的NAA和0.05mg/L的 2, 4-D 為誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基。A B C圖 2 含不同激素的培養(yǎng)基中丹參愈傷A: 6-BA(3 mg/L); B: NAA (0.2 mg/L); C: 2, 4-D (0.05mg/L)Fig. 2 Salvia miltiorrhiza callus in mediums containing different hormonesA: 6-BA(3 mg/L); B: NAA (0.2 mg/L); C: 2, 4-D (0.05mg/L)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3385337