目的克隆地黃Rehmanniaglutinosa毛蕊花糖苷合酶基因（Rg Ac S1）,分析其亞細(xì)胞定位和表達(dá)模式。方法在地黃的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中通過注釋和比對,獲得地黃Rg Ac S1的c DNA序列,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法進(jìn)行分子克隆。構(gòu)建綠色熒光蛋白（GFP）融合表達(dá)載體,以農(nóng)桿菌瞬時表達(dá)法觀測Rg Ac S1的亞細(xì)胞定位。利用實時熒光定量PCR（q RT-PCR）檢測Rg Ac S1基因在地黃塊根不同部位的表達(dá)模式。結(jié)果獲得地黃1個莽草酸-O-羥基肉桂�；D(zhuǎn)移酶的全長編碼序列,c DNA長度為1 659 bp,包含1個1 296 bp的開放閱讀框,編碼431個氨基酸殘基,蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為475 900,具有莽草酸-O-羥基肉桂�；D(zhuǎn)移酶的典型結(jié)構(gòu)域,命名為Rg Ac S1。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示Rg Ac S1主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,在細(xì)胞核中也有分布。q RT-PCR分析表明,Rg Ac S1在地黃的周皮和根毛中表達(dá)量較高,在木質(zhì)部和韌皮部表達(dá)量較低。Rg Ac S1基因在地黃品種北京1號、QH1和85-5中非菊花心中表達(dá)量均高于菊花心中的表達(dá)量,且差異達(dá)極顯著水平。結(jié)論獲... 

【文章來源】：中草藥. 2020,51(18)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

地黃RgAcS1基因的PCR擴增產(chǎn)物檢測

地黃不同品種的菊花心部位與非菊花心部位含量也有明顯差異，分析了Rg Ac S1在地黃品種北京1號、QH1和85-5菊花心和非菊花心部位的表達(dá)量，結(jié)果（圖5）表明，在3個品種非菊花心部位Rg Ac S1的表達(dá)量均明顯高于菊花心部位，北京1號和QH1菊花心和非菊花心部位Rg Ac S1的表達(dá)量均顯著高于85-5。圖5 地黃RgAcS1的表達(dá)模式

為了分析地黃RgAcS1序列與其它已經(jīng)報道的同源蛋白的序列相似性，從NCBI下載了芝麻SiHCT、擬南芥Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.AtHCT、丹參Salvia miltiorrhiza Bunge SmHCT和大豆Glycine max(L.)Merr.GmHCT的氨基酸序列，進(jìn)行多序列聯(lián)配，結(jié)果（圖2-A）表明，地黃RgAcS1與這些HCT蛋白的序列相似性很高，序列一致性在77.96%～92.36%，特別是在植物HCT保守的HxxxD和DFGWG 2個motif，在不同的蛋白間高度保守。進(jìn)而又下載了與RgAcS1序列相似性較高的其它22個物種的同源蛋白序列，利用MEME在線軟件（http://meme-suite.org/）對這25個蛋白的氨基酸序列進(jìn)行保守的基序（motif）挖掘，發(fā)現(xiàn)（圖2-B)HxxxD基序和DFGWG基序分別包含在2個不同的長50 aa的基序內(nèi)，而且序列高度一致，說明HxxxD基序和DFGWG基序在這些蛋白發(fā)揮轉(zhuǎn)移酶活性時非常重要。用在線軟件SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/interactive）對RgAcS1的蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，建模模板為彩葉草Coleus blumei Benth.HCT[13]，發(fā)現(xiàn)（圖2-C)RgAcS1由18個β折疊和17個α螺旋組成，2個大的domain由1個連接環(huán)（Connecting loop）連接。3.3 地黃RgAcS1氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

【參考文獻(xiàn)】：
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