小鼠GABRR2基因克隆表達(dá)及CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯
發(fā)布時間：2021-08-26 05:17
背景GABA是哺乳類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),GABA受體也是臨床上重要的神經(jīng)活性化合物的主要靶點。GABAc受體是視網(wǎng)膜組織中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)性受體,研究表明,激活的GABAC受體能夠抑制雙極神經(jīng)元與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間的谷氨酸釋放,以此來調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜的動態(tài)變化。視網(wǎng)膜病變引起的視神經(jīng)疾病是眼科疾病中的急癥和重癥,對視網(wǎng)膜病變這一大類視神經(jīng)病變過程中的新靶標(biāo)、新途徑的研究仍不全面。本研究應(yīng)用小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGC-5）成功構(gòu)建GABAc受體Rho2基因（GABRR2）過表達(dá)及敲除細(xì)胞系,建立了GABAC離子通道結(jié)構(gòu)及功能篩選平臺,為體外闡述GABAC受體結(jié)構(gòu)功能以及受體同藥物的相互作用奠定基礎(chǔ),以期為疾病干預(yù)和藥物設(shè)計提供新靶標(biāo)和新思路。目的構(gòu)建GABRR2基因過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系以及GABRR2基因敲除細(xì)胞系,研究基因編輯后的雙倍體成體細(xì)胞詳細(xì)的基因型與表現(xiàn)型,以及基因編輯對GABRR2基因外顯子剪切的作用。方法（1）分別以pCMV6-Entry-mRho2以及p IRES-e GFP表達(dá)質(zhì)粒為模板,通過快速克隆法構(gòu)建質(zhì)粒,利用Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染...
【文章來源】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省
【文章頁數(shù)】：83 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
PCR凝膠電泳圖
A. M: DNAmarker; 1: Identification of PCR products of pIRES-eGFP;B. M: DNAmarker; 2: Identification of PCR products of mRho2;C. M: DNAmarker; 2:Identification of colony PCR of positive clone ;1.3.4: Identification of colony PCR of negative clones.ABRR2 基因過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建用Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑將pIRES2-eGFP-mRho2重組質(zhì)粒導(dǎo)入視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)C-5 中，轉(zhuǎn)染 48 h 后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，再利用有限稀釋法進(jìn)行選，篩選出單克隆細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得穩(wěn)定表達(dá) GABRR2 的細(xì)胞系，為 GABRR2 過表達(dá)細(xì)胞系。以野生型 RGC-5 細(xì)胞作為陰性對照，在倒置熒下進(jìn)行觀察，野生型 RGC-5 細(xì)胞無熒光（圖 1-2-A），而過表達(dá)細(xì)胞系可清到存在較強綠色熒光（圖 1-2-B），表明重組 mRho2 質(zhì)粒已在 RGC-5 細(xì)胞達(dá)。
A: 野生型 RGC-5 細(xì)胞系明視野；B：野生型 RGC-5 細(xì)胞熒光視野；C: 過表達(dá) RGC-5 細(xì)胞系明視野；D：過表達(dá) RGC-5 細(xì)胞系熒光視野Fig 1-2. The image of cells after transfection and selection(×200).A: Wild type cell line in bright field; B: Wild type cell line in fluorescence field;: Overexpression cell line in bright field; D:Overexpression cell line in fluorescence field.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測穩(wěn)定表達(dá) GABRR2 的 RGC-5 細(xì)胞數(shù)量流式細(xì)胞儀檢測 GABRR2 過表達(dá)細(xì)胞系中 GFP 陽性細(xì)胞數(shù)量。以野生型 RGC-5 胞 作 為 陰 性 對 照 ， 結(jié) 果 顯 示 在 收 集 的 1×104個 細(xì) 胞 中 ， 穩(wěn) 定 轉(zhuǎn) 染RES2-eGFP-mRho2 質(zhì)粒的 RGC-5 細(xì)胞中 GFP 陽性細(xì)胞占 97%，而野生型 RGC-5胞中 GFP 陽性細(xì)胞比例為 0。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila[J]. Andrew R.Bassett,Ji-Long Liu. Journal of Genetics and Genomics. 2014(01)
本文編號：3363625
【文章來源】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院河南省
【文章頁數(shù)】：83 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
PCR凝膠電泳圖
A. M: DNAmarker; 1: Identification of PCR products of pIRES-eGFP;B. M: DNAmarker; 2: Identification of PCR products of mRho2;C. M: DNAmarker; 2:Identification of colony PCR of positive clone ;1.3.4: Identification of colony PCR of negative clones.ABRR2 基因過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建用Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑將pIRES2-eGFP-mRho2重組質(zhì)粒導(dǎo)入視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)C-5 中，轉(zhuǎn)染 48 h 后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，再利用有限稀釋法進(jìn)行選，篩選出單克隆細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得穩(wěn)定表達(dá) GABRR2 的細(xì)胞系，為 GABRR2 過表達(dá)細(xì)胞系。以野生型 RGC-5 細(xì)胞作為陰性對照，在倒置熒下進(jìn)行觀察，野生型 RGC-5 細(xì)胞無熒光（圖 1-2-A），而過表達(dá)細(xì)胞系可清到存在較強綠色熒光（圖 1-2-B），表明重組 mRho2 質(zhì)粒已在 RGC-5 細(xì)胞達(dá)。
A: 野生型 RGC-5 細(xì)胞系明視野；B：野生型 RGC-5 細(xì)胞熒光視野；C: 過表達(dá) RGC-5 細(xì)胞系明視野；D：過表達(dá) RGC-5 細(xì)胞系熒光視野Fig 1-2. The image of cells after transfection and selection(×200).A: Wild type cell line in bright field; B: Wild type cell line in fluorescence field;: Overexpression cell line in bright field; D:Overexpression cell line in fluorescence field.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測穩(wěn)定表達(dá) GABRR2 的 RGC-5 細(xì)胞數(shù)量流式細(xì)胞儀檢測 GABRR2 過表達(dá)細(xì)胞系中 GFP 陽性細(xì)胞數(shù)量。以野生型 RGC-5 胞 作 為 陰 性 對 照 ， 結(jié) 果 顯 示 在 收 集 的 1×104個 細(xì) 胞 中 ， 穩(wěn) 定 轉(zhuǎn) 染RES2-eGFP-mRho2 質(zhì)粒的 RGC-5 細(xì)胞中 GFP 陽性細(xì)胞占 97%，而野生型 RGC-5胞中 GFP 陽性細(xì)胞比例為 0。
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9 and Genome Editing in Drosophila[J]. Andrew R.Bassett,Ji-Long Liu. Journal of Genetics and Genomics. 2014(01)
本文編號：3363625
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