谷氨酸脫羧酶（Glutamate decarboxylase,GAD）,是能夠?qū)⒐劝彼幔℅lutamate,L-glu）轉(zhuǎn)化成 γ-氨基丁酸的唯一酶。γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid,GABA）,是生物體內(nèi)廣泛存在的一種非蛋白氨基酸,具有許多重要的生理功能,如降低血壓、鎮(zhèn)靜和預(yù)防老年癡呆等,因此,GABA在制藥、食品、保健等行業(yè)存在巨大的應(yīng)用潛能。目前,國(guó)內(nèi)產(chǎn)GABA野生菌株能力較低,同時(shí),在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中,GAD的最適pH偏低,普遍在4.0-5.0之間,當(dāng)pH達(dá)到6.0時(shí),酶就因解聚而失活,不利于工業(yè)應(yīng)用。因此,為了得到能夠高產(chǎn)GABA的菌株和拓寬GAD的pH適應(yīng)范圍,本研究從泡菜樣品中篩選高產(chǎn)GABA的菌株,優(yōu)化其發(fā)酵條件,同時(shí)在體外對(duì)GAD分子進(jìn)行改造。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1.高產(chǎn)GABA菌株的篩選鑒定。本研究以自貢地區(qū)的酸菜為樣品,以乳酸菌產(chǎn)酸分解含有碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基形成溶鈣圈為依據(jù),初步篩選出乳酸菌,再通過(guò)TLC和HPLC法篩選出4株能夠產(chǎn)GABA的菌株,對(duì)4株產(chǎn)GABA的菌株分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),以產(chǎn)GABA的標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC22144為對(duì)照... 

【文章來(lái)源】：四川輕化工大學(xué)四川省

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

E.coli中GABA的合成代謝途徑（Figure1-1ThepathwayofGABAsynthesisandmetabolisminE.coli）[30]

四川輕化工大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文~7~期的處理成本高、效果差，產(chǎn)品純度往往達(dá)不到要求。所以，學(xué)者們對(duì)菌株的相關(guān)基因進(jìn)行克隆表達(dá)，構(gòu)建高效合成GABA的工程菌，以提高GABA的產(chǎn)量，用于食品及保健品的商業(yè)生產(chǎn)[55]。因此利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)GABA，具有重要的商業(yè)價(jià)值，是目前的發(fā)展趨勢(shì)。圖1-2微生物合成GABA反應(yīng)(Figure1-2TheGABAsynthesisbymicroorganisms)1.5研究的目的與意義γ-氨基丁酸作為一種功能因子，具有重要的生理功能。目前，國(guó)內(nèi)微生物發(fā)酵產(chǎn)GABA菌株較少，產(chǎn)量也普遍較低，同時(shí)用于轉(zhuǎn)化生成GABA的GAD的pH適應(yīng)范圍較窄，在工業(yè)應(yīng)用中存在一定的局限性。為了進(jìn)一步提高生物合成GABA的產(chǎn)量，本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵制品酸菜中篩選高產(chǎn)GABA的乳酸菌，隨后對(duì)該高產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，最大限度地發(fā)揮菌種的性能，同時(shí)對(duì)乳酸菌中生成GABA的關(guān)鍵限速酶---谷氨酸脫羧酶（Glutamatedecarboxylase，GAD），利用基因工程手段構(gòu)建表達(dá)載體，在原核大腸桿菌中進(jìn)行外源蛋白的可溶性表達(dá)，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)乳酸菌中GAD基因序列，與已知晶體結(jié)構(gòu)的GAD蛋白進(jìn)行同源建模，進(jìn)行定點(diǎn)突變，拓寬該酶的反應(yīng)pH，一方面得到高產(chǎn)耐中性或近中性環(huán)境的GABA的工程菌，另一方面為探索谷氨酸脫羧酶結(jié)晶條件，解析其空間三維結(jié)構(gòu)，為高產(chǎn)GABA菌株工程改造奠定理論基矗1.6主要研究?jī)?nèi)容（1）高產(chǎn)GABA菌株的篩眩從酸菜、生牛乳等制品中通過(guò)薄層層析、高效液相色譜以及16SrDNA分子生物學(xué)方法，篩選鑒定一株高產(chǎn)GABA的乳酸菌。（2）對(duì)篩選出的乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。初步探討高產(chǎn)GABA乳酸菌的最適培養(yǎng)條件。（3）對(duì)乳酸菌中谷氨酸脫羧酶在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)。構(gòu)建高產(chǎn)γ-氨基丁酸的大腸桿菌工程菌，同時(shí)對(duì)GAD進(jìn)行分離純化，為進(jìn)一步研究其酶?

四川輕化工大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文~14~圖3-1篩選單菌落（Figure3-1Screeningsinglecolony）通過(guò)薄層層析法，定性的檢測(cè)乳酸菌產(chǎn)GABA。以一株產(chǎn)GABA的標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC22144作為陽(yáng)性對(duì)照，篩選得到4株產(chǎn)GABA的乳酸菌，分別編號(hào)為L(zhǎng)iulab5、Liulab23、Liulab37和Liulab84。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3-2所示。圖3-2產(chǎn)GABA乳酸菌TLC結(jié)果（Figure3-2GABAProductionofLactobacillus）圖注：1：GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液；2：谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液；3：GABA與谷氨酸混合液4：Liulab5發(fā)酵液；5：Liulab23發(fā)酵液；6：Liulab37發(fā)酵液7：CICC22144發(fā)酵液；8：Liulab84發(fā)酵液為了定量的檢測(cè)發(fā)酵液中GABA的含量，確定出高產(chǎn)菌株，利用高效液相色譜（HPLC）的方法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值為0.9971，標(biāo)準(zhǔn)曲線有效。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3-3。以標(biāo)準(zhǔn)曲線為參考，分別檢測(cè)發(fā)酵液上清中GABA含量，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到各菌株產(chǎn)GABA的量見(jiàn)表3-1。檢測(cè)結(jié)果表明，Liulab84菌株發(fā)酵產(chǎn)GABA的含量最高，達(dá)到1.92g/L。與標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC22144相比，其含量更高，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)成功篩選出了一株高產(chǎn)GABA的野生乳酸菌菌株。

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號(hào)：3336519