多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）是一類廣泛的存在于植物、動物和微生物中,并且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含銅氧化還原酶。在果蔬褐變過程中發(fā)揮重要作用。當(dāng)果蔬受到機(jī)械損傷后,多酚氧化酶在氧氣存在的情況下催化酚類化合物轉(zhuǎn)化為醌,醌再與氨基酸、蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)進(jìn)行聚合反應(yīng)形成褐色的聚合物,從而導(dǎo)致果蔬因酶促褐變造成重大損失。本研究利用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9分別對主要存在于馬鈴薯塊莖中的多酚氧化酶基因POT32和POT33進(jìn)行編輯,以期降低馬鈴薯塊莖受機(jī)械損傷引發(fā)褐變發(fā)生率,獲得抗褐化馬鈴薯新種質(zhì)。該研究對減少果蔬褐變從而提高經(jīng)濟(jì)效益,創(chuàng)制抗褐化種質(zhì)資源有重大意義。研究取得的主要研究結(jié)果如下:1、成功構(gòu)建靶點特異性gRNA/Cas9植物表達(dá)載體并遺傳轉(zhuǎn)化馬鈴薯本實驗以馬鈴薯大西洋品種作為實驗材料,根據(jù)靶點設(shè)計要求構(gòu)建靶點特異性gRNA/Cas9植物表達(dá)載體,POT32和POT33基因各兩個靶點,分別記作SG5797、SG5798、SG5799和G5800,采用擬南芥U6啟動子啟動gRNA,并采用加強(qiáng)型CaMV35啟動子高效表達(dá)Cas9蛋白,同時表達(dá)潮霉素抗性基因。通過農(nóng)桿菌... 

【文章來源】：貴州大學(xué)貴州省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

馬鈴薯酶促褐變機(jī)理（張學(xué)杰等，2000）

2010 ）。核酸酶(ZFNs)基本結(jié)構(gòu)和作用原理(ZFNs)是一種經(jīng)人工合成的鋅指核酸酶,包括 N 端和 C 端。N 端是由NA 序列的鋅指蛋白(zinc finger protein, ZFP)結(jié)構(gòu)域，C 端是由 Fok I 其中鋅指(zinc finger, ZF)是 ZFP 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的基本單位，并且 ZF 廣，還能介導(dǎo)蛋白質(zhì)與核酸、小分子物質(zhì)或者其它蛋白質(zhì)之間特異性的10)。ZFP 結(jié)構(gòu)域通常由 3-6 個鋅指的重復(fù)單位經(jīng)過串聯(lián)構(gòu)成，并且與控相關(guān)，其中每個鋅指能夠直接特異性的識別 DNA 雙鏈中其中一條個核苷酸序列，通過將多個鋅指串聯(lián)組成的 ZFP 結(jié)構(gòu)域能夠識別更多也增強(qiáng) DNA 靶向修飾的特異性(Kim et al., 1996;鐘強(qiáng)和趙書紅,2010)

并且在兩個結(jié)合位點間（5-7 bp）發(fā)生切割，引起 DNA 雙鍵出現(xiàn)斷裂 (Miller et al.,985; Wolfe et al., 2000)如圖 2(Porteus et al., 2005)，從而導(dǎo)致同源重組或者非同源末端連對雙鏈的修復(fù)，修復(fù)過程存在自發(fā)錯誤以及人為引入的變化，從而對基因組 DNA 序引發(fā)改變，實現(xiàn)基因定點的突變目的。.5.2 類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶基本結(jié)構(gòu)和作用原理轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALENs) 是經(jīng)過人工改造的核酸內(nèi)切酶，在結(jié)構(gòu)上包括異性蛋白結(jié)合域以及非特異性的切割域兩部分( Boch et al, 2009;Moscou et al., Moscout al., 2009)，TALEN 的切割域和 ZFN 的切割域類似，也是 Fok I 內(nèi)切酶 ；TALEN 的合域是經(jīng)過人工改造的 TALE 蛋白，TALE 蛋白源自于黃單胞桿菌（Xanthomonas）。 ZFN 相似，根據(jù)靶點位置兩側(cè)序列設(shè)計一對 TALEN，通過特異識別 DNA 序列后，個 Fok I 單體通過相互作用可形成二聚體，再對靶標(biāo)序列進(jìn)行切割從而進(jìn)行基因修飾Boch J, 2011)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]采用人造小RNA技術(shù)抑制馬鈴薯多酚氧化酶的研究[D]. 池明.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2014

碩士論文
[1]應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得高直鏈淀粉馬鈴薯[D]. 潘京.內(nèi)蒙古大學(xué) 2017
[2]馬鈴薯多酚氧化酶性質(zhì)及抑制劑作用機(jī)理的研究[D]. 黃浩.廈門大學(xué) 2006



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