銀耳芽孢是銀耳（Tremella fuciformis）擔(dān)孢子芽殖產(chǎn)生的酵母狀分生孢子,可通過(guò)芽殖方式無(wú)限繁殖,且生長(zhǎng)快速、易于培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化,具備作為生物反應(yīng)器的潛質(zhì)。目前已有多種基因在銀耳芽孢中表達(dá)成功,但是表達(dá)量偏低,缺乏安全有效的抗性篩選標(biāo)記,表達(dá)體系尚不完善;目前實(shí)驗(yàn)室已在銀耳芽孢中成功獲得rfp基因的表達(dá),但是HIV-TAT-survivin（T34A）突變體基因（TAT-survivin（T34A））未表達(dá)成功。為改善這些問(wèn)題,本研究以PNP（經(jīng)酵母表達(dá)載體pPICZA改造而成）為表達(dá)載體,以lacZ基因?yàn)閳?bào)告基因,通過(guò)替換外源基因表達(dá)啟動(dòng)子的方法構(gòu)建銀耳芽孢外源基因表達(dá)載體,通過(guò)比較β-半乳糖苷酶活性篩選最佳啟動(dòng)子,采用該啟動(dòng)子構(gòu)建rfp基因與TAT-survivin（T34A）的融合表達(dá)載體表達(dá)TAT-survivin（T34A）蛋白。具體內(nèi)容與結(jié)果如下:1.外源基因表達(dá)載體、篩選標(biāo)記與轉(zhuǎn)化方法的選擇通過(guò)比較pCAMBIA1301、PNP載體的轉(zhuǎn)化效果以及潮霉素B、zeocinTM抗生素篩選效果,發(fā)現(xiàn)銀耳芽孢對(duì)zeocinTM敏感,最低篩選濃度為25μg·mL-1 PNP... 

【文章來(lái)源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁(yè)數(shù)】：93 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－５?ＰＮＰ－ｌａｃＺ載體菌液ＰＣＲ驗(yàn)證結(jié)果??Ｆｉｇ．?１－５?Ｔｈｅ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ＰＮＰ－ｌａｃＺ?ｖｅｃｔｏｒ??

１４／ａｃＺ基因的擴(kuò)增電泳?１－４?Ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｌａｃＺ?ａｒｋｅｒ；泳道１：?／％Ｚ基５?４?３?２?１?Ｍ???５０３０ＮＰ－ｌａｃＺ載體菌液ＰＣＲ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ＰＮＰ１－６：?ＰＮＰ－ｌａｃＺ陽(yáng)性克隆以通用引物３’ＡＯＸ丨

?２６００?３２５０??圖１－７測(cè)序結(jié)果ＮＣＢＩ在線比對(duì)分析結(jié)果??Ｆｉｇ．?１－７?ＮＣＢＩ?Ｂｌａｓｔ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｒｅｓｕｌｔ??３．６重組質(zhì)粒ＰＮＰ－ｌａｃＺ轉(zhuǎn)化銀耳芽孢結(jié)果??重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化銀耳芽孢的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入質(zhì)粒ＰＮＰ－ｌａｃＺ的實(shí)驗(yàn)組從第７天??開(kāi)始長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子，到第１２天左右基本全部長(zhǎng)出（如圖１－８?ｃ）；未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒ＰＮＰ－ｌａｃＺ??的對(duì)照組１涂布到含有５０?ｐｇ?ｍＬ－１?ｚｅｏｃｉｎ？的ＣＭ平板上，直到第１５?ｄ未發(fā)現(xiàn)有??任何菌落長(zhǎng)出（如圖１－８?ａ）；而涂布到不含任何抗生素的平板上的對(duì)照組２則??菌落長(zhǎng)滿了平板（如圖１－８?ｂ），對(duì)照組２菌落從第５天開(kāi)始陸續(xù)長(zhǎng)出，這一時(shí)??間要早于實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出的時(shí)間，但是要比未處理過(guò)得銀耳芽孢的生長(zhǎng)速度??慢。這或許是因?yàn)殡姄艮D(zhuǎn)化處理過(guò)后銀耳芽孢需要一段時(shí)間的復(fù)蘇才開(kāi)始生長(zhǎng)繁??殖。轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，采用ｚｅｏｃｉｎ抗性基因篩選標(biāo)記，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法可以有效地??獲得銀耳芽孢的轉(zhuǎn)化子。??■０１圓??圖１－８?ＰＮＰ－ｌａｃＺ載體轉(zhuǎn)化銀耳芽孢??Ｆｉｇ．?１－８?ＰＮＰ－ｌａｃＺ?ｖｅｃｔｏｒ?ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ?ｉｎｔｏ?Ｔ．?ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ?ｙｅａｓｔ－ｌｉｋｅ?ｃｏｎｉｄｉａ??ａ：對(duì)照組１?（不轉(zhuǎn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，涂布ｚｅｏｃｉｎ抗生素平板）；ｂ：對(duì)照組２?（不轉(zhuǎn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，涂??布不含抗生素平板）；ｃ：電擊轉(zhuǎn)入ＰＮＰ－ｌａｃＺ載體后長(zhǎng)出的菌落??３．７重組質(zhì)粒ＰＮＰ－ｌａｃＺ轉(zhuǎn)化子鑒定結(jié)果??隨機(jī)挑取６個(gè)擬轉(zhuǎn)化子

【參考文獻(xiàn)】：
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博士論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3309664