阿爾茨海默�。ˋlzheimerdisease,AD）是以學(xué)習(xí)記憶障礙為主要特征并且與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病。隨著全球老齡化現(xiàn)象的加重,阿爾茨海默病的患病人數(shù)在不斷增加,造成的社會問題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)日益嚴(yán)重,遺憾的是,AD的具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚,因此,進(jìn)一步的實驗探討和新的靶點篩選將是目前的研究方向。本實驗通過鋁中毒模型,確證差異表達(dá)的基因mmp9,并且利用Crispr/Cas9技術(shù)建立了 mmp9的基因敲除斑馬魚模型,聯(lián)合APPsw斑馬魚癡呆模型及鋁中毒,探討mmp9基因在AD發(fā)生中的作用,為阿爾茨海默病的治療提供新的靶點。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1、mmp9基因上調(diào)在鋁中毒斑馬魚模型中的驗證實驗室前期斑馬魚鋁中毒模型的基因芯片結(jié)果顯示,mmp9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高,本實驗利用野生型斑馬魚經(jīng)100μg/L、pH==5.8的酸性AlC13處理40天,RT-qPCR驗證腦內(nèi)mmp9 mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)（p<0.05）。2、mmp9基因敲除模型的建立利用CHOPCHOP網(wǎng)站,篩選敲除靶位點。構(gòu)建pT7-mmp9-gRNA體外轉(zhuǎn)錄模板并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將體外轉(zhuǎn)錄的特異性gRNA（終濃度... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２顯微注射示意圖??Ｆｉｇ．?２?Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ??（二）酶切及Ｓａｎｇｅｒ測序??

應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行編號并禁止喂食。實驗開始時，用擋??板擋住長臂口，將斑馬魚放入起始區(qū)，２?ｍｉｎ后，抽開擋板，利用行為學(xué)記錄系統(tǒng)，??追蹤并記錄斑馬魚找到ＥＣ區(qū)的時間。觀察時間為６?ｍｉｎ，?６?ｍｉｎ內(nèi)成功進(jìn)入ＥＣ區(qū)的??斑馬魚，在ＥＣ區(qū)投喂食物進(jìn)行獎勵，６?ｍｉｎ內(nèi)未進(jìn)入ＥＣ的斑馬魚引導(dǎo)其進(jìn)入ＥＣ區(qū)，??停留３?ｍｉｎ并給予食物。每天上午９點開始，連續(xù)測試４天。??．翻??Ｉ—：廠ｒ碰１??？?ＥＣ區(qū)??ｒ￣＂?？＇￣３??ｓｔａｒｔ??Ｌ：：：?一』??圖３?：?“Ｔ”迷宮結(jié)構(gòu)圖??Ｉ－ｉｇ．?３?Ｉ?ｈｃ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?Ｔ?ｍａｚｅ??１．２．３．３病理學(xué)檢測??（一）斑馬魚腦組織提取制片??每個模型組選�。硹l斑馬魚，冰上麻醉，在體式顯微鏡下取出完整腦組織，用４％??的多聚甲醛固定２４?ｈ，送公司制作石蠟切片。切片厚度為６?ｐｍ，將切片粘在防脫片??的載玻片上，６０°Ｃ烤片６?ｈ，得到數(shù)張白片用于后續(xù)試驗。??２１??

ＡｂＤ?Ｍ?１?Ｂ??Ｂ；?Ｍ?ｍｌ?ｍ２?ｍ３?ｍ４??辦‘．‘：??圖?５?ｐＴ７－ｇＲＮＡ?質(zhì)粒酶切（Ａ）?ｍｌ－ｎｉ４ｇＲＮＡ?（Ｂ）電泳圖??Ｆｉｇ．５?Ｔｈｅ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｌｉｏｒｅｓｉｓ?ｍａｐ?ｏｆｌｉｎａｒ?ｐＴ７－ｇＲＮＡ?（Ａ）?ａｎｄｍｌ－ｍ４ｇＲＮＡ?（Ｂ）??Ｍ：ＤＮＡＭａｒｋｅｒ，１：?ｐＴ７－ｇＲＮＡ?質(zhì)粒釀丨刀產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄后?ｐＴ７－／？ｗ；？９－ｇＲＮＡ??Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ，?１－２：?Ｔｈｅ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ｐＴ７－；ｗｍ／？９－ｇＲＮＡ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ??２．２＿３?Ｃａｓ９?ｍＲＮＡ的制備結(jié)果??利用核酸內(nèi)切酶Ｎｏｔ?Ｉ酶切ｐＣＳ２－ｎＣａｓ９ｎ質(zhì)粒，獲得線性化ｐＣＳ２－ｎＣａｓ９ｎ，見圖??６Ａ，利用ｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥ？ＳＰ６試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄結(jié)果如圖６Ｂ。??條帶大小正確，Ｃａｓ９?ｍＲＮＡ制備成功。??ｍｍ??圖６?ｐＣＳ２－ｎＣａｓ９ｎ質(zhì)粒酶切（Ａ）和Ｃａｓ９?ｉｎＲＮＡ轉(zhuǎn)錄電泳圖??Ｆｉｇ．?６?Ｔｈｅ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｍａｐ?ｏｆｌｉｎａｒ?ｐＣＳ２－ｎＣａｓ９ｎ?（Ａ）?ａｎｄ?Ｃａｓ９?ｍＲＮＡ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ??Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ?５０００，線性化?ｐＣＳ２－ｎＣａｓ９ｎ?質(zhì)粒，２：?Ｃａｓ９?ｍＲＮＡ??Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ?５０００，?１：?Ｌｉｎａｒ?ｏｆ?ｐＣＳ２－ｎＣａｓ９ｎ?ｐｌａｓｍｉｄ，?２：?Ｃａｓ９?ｍＲＮＡ??２７??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]鋁對斑馬魚幼魚運動行為的影響及其機(jī)制[J]. 談勇,許夢川,王遠(yuǎn),張芳,李小滿,陳豪,趙寶全,汪雪雁.  中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志. 2018(03)
[2]22種山茶科植物葉片鋁含量及其亞細(xì)胞分布[J]. 渠心靜,陳雪燕,戴生玉,袁軍.  分子植物育種. 2018(03)
[3]深圳市2015年市售茶葉中金屬污染現(xiàn)況及健康風(fēng)險評估[J]. 楊淋清,王舟,潘柳波,張慧敏,羅賢如,李思果,張錦周,黃薇.  中國熱帶醫(yī)學(xué). 2017(12)
[4]2013-2016年濟(jì)南市膳食食品中鋁殘留量監(jiān)測及人群暴露評估[J]. 焦海濤,張鑫,楊曉倩,孫延斌,曹小麗,劉仲,劉素華.  現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué). 2017(16)
[5]阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制及治療藥物研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)俠,吳振,雷嚴(yán),王立強(qiáng).  中國藥房. 2014(33)
[6]胰島素抵抗與胰島素信號通路的相關(guān)關(guān)系研究進(jìn)展[J]. 王廷偉,陳秋.  西南軍醫(yī). 2014(01)
[7]鋁電解工業(yè)PM2.5超細(xì)粉塵的控制技術(shù)研究[J]. 呂維寧,鄧翔.  中國環(huán)保產(chǎn)業(yè). 2013(09)
[8]以斑馬魚為模式動物研究生物分子對血腦屏障的通透性[J]. 付愛玲,陳亨宇,徐興然,趙寶全.  藥學(xué)學(xué)報. 2012(11)
[9]Gelatin degradation assay reveals MMP-9 inhibitors and function of O-glycosylated domain[J]. Jennifer Vandooren,Nathalie Geurts,Erik Martens,Philippe E Van den Steen,Steven De Jonghe,Piet Herdewijn,Ghislain Opdenakker.  World Journal of Biological Chemistry. 2011(01)
[10]鋁在阿爾茨海默氏病和帕金森氏病及透析病發(fā)病中的毒性及減輕鋁負(fù)荷的藥物研究進(jìn)展[J]. 章福平,畢樹平.  無機(jī)化學(xué)學(xué)報. 2000(03)

博士論文
[1]基于APP阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因模型的腦微血管和神經(jīng)元病變相關(guān)性研究[D]. 蒲韻竹.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 2017

碩士論文
[1]斑馬魚UCP2基因敲除模型的建立及鋁毒性的初步研究[D]. 談勇.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[2]斑馬魚腦組織結(jié)構(gòu)特性研究[D]. 陳微.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]鋁對斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其相關(guān)機(jī)制初步研究[D]. 李春杰.西南大學(xué) 2014
[4]斑馬魚阿爾茨海默病動物模型的建立[D]. 蒲韻竹.西南大學(xué) 2013



本文編號：3296669