發(fā)布時(shí)間：2021-07-10 20:17

　　我國(guó)作為人口大國(guó),確保糧食產(chǎn)量穩(wěn)定是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的重要問(wèn)題。針對(duì)有限的土地資源,培育多抗、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的品種是確保糧食安全的根本途徑。雜交育種等傳統(tǒng)方法由于具有分子機(jī)理不清、針對(duì)性較差及選育周期較長(zhǎng)等問(wèn)題,已經(jīng)逐漸難以適應(yīng)日益提高的育種目標(biāo),而CRISPR/Cas9技術(shù)通過(guò)編輯植物內(nèi)源基因來(lái)改良抗性、提高產(chǎn)量,具有高效、精準(zhǔn)的特點(diǎn)。YH208（宜恢208,秈稻）具有產(chǎn)量高、米質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn),但易感稻瘟病,而攜帶隱性抗性的Pi21等位基因?qū)?0株稻瘟病生理小種具有抗性。DS（粳稻）具有耐寒、米質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn),但其株高過(guò)高、易倒伏、分蘗少,而據(jù)報(bào)道D3基因負(fù)調(diào)控分蘗和株高。為此,我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)YH208的Pi21和DS的D3基因進(jìn)行編輯以期改良其抗性或株型;同時(shí)為進(jìn)一步探究Pi21、D3的作用機(jī)制以及水稻遺傳改良提供材料基礎(chǔ)。結(jié)果如下:1、利用CRISPR/Cas9編輯Pi21基因改良YH208的抗性,前期我們篩選到一份高感穗頸瘟的恢復(fù)系YH208（宜恢208）,將其與Pi21感病等位基因進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)在其238-247、454-468處有1bp的置換（C替換成T）以及9b... 

【文章來(lái)源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：74 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

YH208中Pi21與已報(bào)道的抗、感Pi21等位基因序列比對(duì)Fig.3-1SequencealignmentofthePi21alleleinYH208andthereportedresistantandsusceptiblePi21

22圖3-1YH208中Pi21與已報(bào)道的抗、感Pi21等位基因序列比對(duì)Fig.3-1SequencealignmentofthePi21alleleinYH208andthereportedresistantandsusceptiblePi21alleles注：A,B.分別為宜恢208中Pi21與已報(bào)道的抗、感Pi21等位基因的CDS、氨基酸序列比對(duì)結(jié)果。3.1.2敲除Pi21基因靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)及脫靶分析我們利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯系統(tǒng)來(lái)對(duì)水稻YH208內(nèi)源基因Pi21進(jìn)行敲除，因前人報(bào)道與感病等位基因相比，Pi21抗病等位基因分別有21bp和48bp的缺失[103]，為此，我們通過(guò)（http://skl.scau.edu.cn/targetdesign/）網(wǎng)站在第二外顯子上這兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)前設(shè)計(jì)了兩個(gè)靶位點(diǎn)（圖3-2），之后將目標(biāo)序列構(gòu)建到sgRNA/Cas9載體上，通過(guò)土壤農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因水稻。此外，為了檢測(cè)CRISPR/Cas9在水稻中的特異性，避免脫靶效應(yīng)影響突變體表型，我們通過(guò)CRISPR/Cas9在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://skl.scau.edu.cn/offtarget/)工具分析了兩個(gè)靶位點(diǎn)的潛在脫靶位點(diǎn)。以日本晴作為參考基因組，分析結(jié)果顯示所有檢測(cè)的潛在脫靶位點(diǎn)與兩個(gè)靶位點(diǎn)相比都有3-5bp不相匹配，表明兩個(gè)靶位點(diǎn)具有較好的特異性（表3-1,3-2）。圖3-2Pi21的基因結(jié)構(gòu)和兩個(gè)靶位點(diǎn)的位置Fig.3-2ThegenestructureofPi21andthelocationoftwotargetsites注：內(nèi)含子用直線表示，外顯子用藍(lán)色方框表示，非編碼區(qū)域用白色方框表示，靶位點(diǎn)1、2用紅色方框表示。

24型（圖3-3A,B），其中KO#1和KO#2從靶位點(diǎn)1開(kāi)始產(chǎn)生移碼突變，而KO#2移碼突變導(dǎo)致提前出現(xiàn)終止密碼子，KO#4從靶位點(diǎn)2開(kāi)始產(chǎn)生移碼突變并產(chǎn)生提前終止密碼子，KO#3在兩個(gè)靶位點(diǎn)處分別缺失9、1個(gè)氨基酸序列，KO#5僅在兩個(gè)靶位點(diǎn)之間出現(xiàn)移碼突變（圖3-3C）。ABC圖3-3突變體與野生型中Pi21序列比對(duì)分析

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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