CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建,若能構(gòu)建出一種能連續(xù)進(jìn)行基因編輯的CRISPR/Cas9系統(tǒng),將極大地提高大腸桿菌工程菌株構(gòu)建的效率。設(shè)計(jì)并構(gòu)建了具有自剪切功能的供體質(zhì)粒pV4,優(yōu)化了雙質(zhì)粒CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了基因的連續(xù)敲除或整合。pV4質(zhì)粒,在原始供體質(zhì)粒placZ的骨架區(qū)域添加3個(gè)元件:針對(duì)供體質(zhì)粒上氯霉素基因cat的N20-gRNA序列;Ptrc啟動(dòng)子,用于表達(dá)cat-N20-gRNA;lacI^q序列,用于表達(dá)LacI蛋白調(diào)控Ptrc啟動(dòng)子。pV4供體系列質(zhì)粒（敲除或整合）實(shí)現(xiàn)基因編輯后,cat-N20-gRNA在IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)供體質(zhì)粒進(jìn)行自剪切,從而方便下一輪基因的編輯。將pV4系列質(zhì)粒（敲除或整合）應(yīng)用于產(chǎn)衣康酸工程菌株的構(gòu)建,連續(xù)敲除ptsI、iclR及整合cad基因,基因編輯結(jié)果顯示,優(yōu)化后的雙質(zhì)粒CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),能快速消除供體質(zhì)粒,實(shí)現(xiàn)基因的連續(xù)敲除或整合,節(jié)約了基因操作的時(shí)間,有廣泛的工程菌株構(gòu)建應(yīng)用前景。 

【文章來源】：生物學(xué)雜志. 2020,37(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

優(yōu)化大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)

為優(yōu)化雙質(zhì)粒CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的連續(xù)編輯,對(duì)供體DNA質(zhì)粒進(jìn)行了改造:在供體質(zhì)粒placZ的骨架區(qū)域添加上3個(gè)元件:cat-N20-gRNA元件,以placZ質(zhì)粒為模板,用引物cat-N20-up/cat-N20-down擴(kuò)增得到,大小400 bp(圖2-A,泳道2);元件lacIq和元件Ptrc在質(zhì)粒pMACYC184上相鄰,用引物lacI-Ptrc-up/lacI-Ptrc-down擴(kuò)增得到,大小1.5 kb(圖2-A,泳道3)。將這3個(gè)元件和placZ反向擴(kuò)增的骨架片段(圖2-A,泳道1)用Golden Gate策略組裝,得到pV4質(zhì)粒(圖2-B)。pV4質(zhì)粒含有自剪切元件lacIq-Ptrc-cat-N20-gRNA,在IPTG誘導(dǎo)和Cas9蛋白作用下,可以實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒的自我消除。2.3 應(yīng)用優(yōu)化的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)快速構(gòu)建工程菌株

按照Golden Gate的片段組裝策略,分別組裝ptsI、iclR敲除型質(zhì)粒和cad整合型質(zhì)粒。組裝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans T1感受態(tài)細(xì)胞,得到的克隆PCR驗(yàn)證分析后送樣測(cè)序,組裝正確的效率達(dá)到100%。pV4-del-ptsI,pV4-del-iclR和pV4-del-araBAD-ins-cad的質(zhì)粒電泳圖,見圖3-D 泳道1、2和3。2.3.2 基因的連續(xù)敲除及其供體質(zhì)粒的消除

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]改造大腸桿菌提高丁二酸生產(chǎn)速率和轉(zhuǎn)化率[D]. 陳晶.天津科技大學(xué) 2014



本文編號(hào)：3251672