外顯子連接復(fù)合體（exon j unction complex,EJC）位于核質(zhì)中,參與內(nèi)含子的剪接過(guò)程,在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。本研究以羽衣甘藍(lán)（Brassica oleracea var.acephala）作為實(shí)驗(yàn)材料,其屬于十字花科蕓薹屬,為我國(guó)北方重要的觀賞和食用植物。柱頭作為花粉接受的場(chǎng)所,其生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)植物是否能夠繁殖起到了極其重要的作用。為了進(jìn)一步探討EJC及其核心外圍互作蛋白在參與調(diào)控柱頭發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制,我們分離了羽衣甘藍(lán)柱頭中EJC核心蛋白基因Mago,eIF4AⅢ和UAP56,及EJC外圍蛋白基因GRP、CP29A;利用原核表達(dá)純化技術(shù)得到了這些基因的蛋白,并且制備了其多克隆抗體。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分析BoMago、BoeIF4AⅢ、BoUAP56基因在柱頭發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)量情況;通過(guò)免疫印跡的方法檢測(cè)BoMago、BoeIF4AⅢ、BoUAP56蛋白在柱頭發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)情況;最后通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)分析蛋白質(zhì)間的相互作用。主要獲得的研究結(jié)果如下:（1）羽衣甘藍(lán)BoMago開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)447 bp,編碼148個(gè)氨基酸;BoeIF4AⅢ開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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圖２－１羽衣甘藍(lán)柱頭總ＲＮＡ的提取結(jié)果??

５Ｓ??圖２－１羽衣甘藍(lán)柱頭總ＲＮＡ的提取結(jié)果??２．３＿２?ＲＴ－ＰＣＲ克隆基因??以羽衣甘藍(lán)柱頭總ＲＮＡ為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得ｃＤＮＡ，以ｐＥＴ引物進(jìn)行ＰＣＲ反應(yīng)。??在１２００?ｂｐ左右得到了兩條明顯的條帶，在５００?ｂｐ左右得到了三條明顯的條帶，在９００?ｂｐ??左右得到了一條明顯的條帶都與預(yù)期基因的大小相苻（如圖２－２所示）。將目的片段與??酶切后的ｐＥＴ－１４ｂ載體連接后轉(zhuǎn)化ＤＨ５ｏｔ感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌液ＰＣＲ結(jié)果與預(yù)期基因大??小相符（如圖２－３所示）。??

３?ＥＪＣ在柱頭發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)分析??３．３結(jié)果與分析??３．３．１羽衣甘藍(lán)不同發(fā)育時(shí)期柱頭總ＲＮＡ的提取??收集Ｓ卜Ｓ５時(shí)期羽衣甘藍(lán)柱頭并提取總ＲＮＡ，通過(guò)ＮａｎｏＤｒｏｐ－２０００測(cè)量，ＯＤ２６０／２８０??值均在１．８－２．０。瓊脂糖凝膠電泳表明（圖３－１），柱頭ＲＮＡ良好無(wú)明顯降解，可用于后續(xù)??實(shí)驗(yàn)，通過(guò)ＮａｎｏＤｒｏｐ－２０００測(cè)量并調(diào)整Ｓ１－Ｓ５時(shí)期ＲＮＡ溶液濃度一致約為１?ｐｇ／ｎＬ左右。??Ｓ１??２８Ｓ??ｉ８ｓ??圖３－１：?Ｓ１時(shí)期柱頭總ＲＮＡ電泳圖??３．３．２?ｑＲＴ－ＰＣＲ引物特異性檢測(cè)??提取羽衣甘藍(lán)Ｓ１－Ｓ５時(shí)期柱頭ＲＮＡ，去除基因組ＤＮＡ后，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得??ｃＤＮＡ。分另ＩＪ對(duì)５ｏＭａｇｏ、尸允基因?qū)崟r(shí)定量引物進(jìn)行ＰＣＲ，通過(guò)瓊月旨??糖凝膠電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出的基因條帶單一，并與預(yù)期結(jié)果一致（圖３－２）。說(shuō)明引物??特異性較好，可用于ｑＲＴ－ＰＣＲ的分析。??ｂｐ?Ｍ?１?２?３??１００??圖３－２：?ｑＲＴ－ＰＣＲ引物特異性檢測(cè)??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ＢｏＭａｇｏ；?２：?ＢｏｅＩＦ４Ａ；?３：?ＢｏＵＡＰ５６??３．３．３?ＢｏＭａｇｏｘ?ＢｏｅＩＦ４ＡｌＩＩｓ?ＢｏＵＡＰ５６＾＾＾Ｕ??為了研究５ｏＭａｇｏ、５ｏｅ／／４４／／／、５〇似戶(hù)５６基因在柱頭發(fā)育Ｓ１－Ｓ５時(shí)期的表達(dá)情況，??以Ａｃｔｉｎ作為內(nèi)參基因進(jìn)行了?ｑＲＴ－ＰＣＲ分析ｉ＾７ＡＰ５６基因在柱??頭發(fā)育各時(shí)期的相對(duì)表達(dá)情況（如圖３－３）。發(fā)現(xiàn)這三個(gè)基因在柱頭發(fā)育早期Ｓ１時(shí)期具??有最高的表達(dá)量，隨著柱頭的成熟表達(dá)量下降，Ｓ５時(shí)期表達(dá)量最低。??－３５－??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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