本文從一份糙米樣品中分離純化出5株細(xì)菌,分別命名為BR1、BR2、BR3、BR4和BR5,對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定、16S rRNA及gyr B基因測序鑒定,并對其毒力基因及藥物敏感性等生物學(xué)特征進(jìn)行研究。結(jié)果表明,5株分離菌株生化特性符合蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的特性,結(jié)合16S rRNA及gyr B基因測序結(jié)果,菌株BR1和BR4鑒定為蠟樣芽孢桿菌。毒力基因的PCR檢測結(jié)果表明,菌株BR1和BR4攜帶腸毒素基因（hbl、nhe、ent FM和bce T）和細(xì)胞毒素K基因（cyt K）,未檢測到嘔吐型毒力基因（cer和ces）。菌株BR1和BR4對青霉素、氨芐西林和頭孢噻肟等藥物耐藥,對阿莫西林中度敏感,對諾氟沙星、環(huán)丙沙星和慶大霉素等藥物敏感。本研究通過分離鑒定糙米源蠟樣芽孢桿菌,發(fā)現(xiàn)分離菌株攜帶多種毒力基因,并且對青霉素類、頭孢菌素類及磺胺類等藥物耐藥,表明糙米中的蠟樣芽孢桿菌有引起食源性疾病的風(fēng)險。 

【文章來源】：現(xiàn)代食品科技. 2020,36(10)北大核心

【文章頁數(shù)】：10 頁

【部分圖文】：

圖1 分離菌株形態(tài)學(xué)特征：（a）營養(yǎng)瓊脂；（b）甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養(yǎng)基；（c）胰酪胨大豆羊血瓊脂；（d）蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶染色；（e）芽孢染色

經(jīng)PCR檢測，試驗(yàn)結(jié)果表明分離菌株BR1的DNA中除hbl B、ces和cer外，剩余9種毒力基因hbl A、hbl C、hbl D、nhe A、nhe B、nhe C、ent FM、cyt K和bce T均能檢測到。并測得9種毒力基因片段大小分別為1154、740、829、500、770、582、1269、812和428 bp左右（圖6）。分離菌株BR4的DNA中除ces和cer外，剩余10種毒力基因均存在（圖7）。由此可知，菌株BR1攜帶溶血性腸毒素毒力基因hbl A、hbl C、hbl D，非溶血性腸毒素毒力基因nhe A、nhe B、nhe C及腸毒素毒力基因ent FM、bce T，細(xì)胞毒素毒力基因cyt K，不攜帶嘔吐型毒素毒力基因ces、cer。菌株BR4還含有溶血性腸毒素毒力基因hbl B。蠟樣芽孢桿菌的致病性與其攜帶的毒力基因直接相關(guān)，溶血性腸毒素BL(Hbl）和非溶血性腸毒素（Nhe）均為復(fù)合型毒素，全部組分的共同參與能使其毒力達(dá)到最大，有研究顯示只有含有Hbl全部基因的菌株才會產(chǎn)生溶血效應(yīng)[12]。毒力基因檢測結(jié)果表明，菌株BR1和BR4含有Hbl三個全部基因，說明這兩株分離菌株能夠產(chǎn)生溶血毒素Hbl，對消費(fèi)者會產(chǎn)生危害。此外，非溶血性腸毒素nhe基因（nhe A、nhe B、nhe C）、腸毒素毒力基因ent FM、bce T和細(xì)胞毒素毒力基因cyt K均在菌株BR1和BR4中被檢出，這些毒素基因同樣能引起消費(fèi)者腹瀉等不良反應(yīng)。本研究毒力基因攜帶結(jié)果與崔一龍等[24]、宋麗麗等[25]結(jié)果基本一致，即hbl、nhe、cyt K、ent FM和bce T基因的檢出率偏高，這些毒力基因編碼的毒素也被認(rèn)為是我國食源性蠟樣芽孢桿菌的主要毒力因子[12]。張明明等[15]針對餐飲服務(wù)場所即食米面制品中蠟樣芽孢桿菌的污染狀況進(jìn)行研究，檢出蠟樣芽孢桿菌49株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有分離菌株均檢出兩種或兩種以上的毒力基因，其中非溶血性腸毒素基因nhe和ent FM檢出率最高，同時攜帶nhe三個基因又?jǐn)y帶hbl A、hbl C和hbl D基因的強(qiáng)毒株有7株，占4.29%。本研究中菌株BR1和BR4都同時攜帶3種及以上BL和Nhe毒力基因，表明其具有強(qiáng)致腹瀉功能。綜上所述，溶血性腸毒素BL基因、非溶血性腸毒素Nhe基因和細(xì)胞毒素基因是目前淀粉質(zhì)食物糙米中蠟樣芽孢桿菌菌株攜帶的主要毒素基因，以引起消費(fèi)者腹瀉等不良反應(yīng)為主。2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 菌株16S r RNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果及進(jìn)化樹分析常用細(xì)菌的分類主要從菌落的形態(tài)特征及一系列生理生化試驗(yàn)來確定[16]。然而傳統(tǒng)的分類鑒別方法步驟繁瑣、鑒定周期較長，且大多性狀由主觀來判斷，易給試驗(yàn)結(jié)果判定帶來誤差。由于16S r DNA的信息量足夠大，序列大小適中（1.5 kb），在進(jìn)化上速度慢，并且在本質(zhì)上和功能上具有高度的保守性，因而被選作生物進(jìn)化過程中的標(biāo)尺，常用于生物的系統(tǒng)分類[17]。鑒定的5株分離菌BR1、BR2、BR3、BR4和BR516S r RNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，5株分離菌在1500 bp位置都出現(xiàn)寬亮條帶，測序結(jié)果表明菌株BR1、BR2、BR3、BR4和BR5的16S r RNA基因序列長度均在1500 bp左右。將測得的16S r RNA基因序列提交到NCBI和Ez Bio Cloud核酸數(shù)據(jù)庫中行BLAST在線分析。運(yùn)用MEGA 7.0軟件，將測出的序列與16S r RNA基因序列進(jìn)行同源性對比。菌株BR1、BR2、BR3、BR4和BR5的16S r RNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。根據(jù)圖3中16S r RNA基因序列分析結(jié)果，菌株BR1、BR2、BR3、BR4和BR5 16S r RNA基因序列與多種芽孢桿菌如蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus ATCC 14579）、蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides DSM 2048）及蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis ATCC 10792）等同源性均很高，因此可初步將5株分離菌株歸類為芽孢桿菌屬，然而無法確定5株分離菌株具體為哪一種菌。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]1株牛源蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定及毒力基因檢測[J]. 宋麗麗,張玲艷,賈偉娟,白志恒,劉媛,陳云嬌,王學(xué)理.  西北農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2019(11)
[2]豬源蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定與部分生物學(xué)特性分析[J]. 江地科,項(xiàng)明源,王印,姚學(xué)萍,楊澤曉,張鵬飛,廖倡宇,朱光恒,姜睿嬌.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2019(10)
[3]鯽魚腸道蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特征[J]. 陳豐,黃亞冬,孫敬鋒,呂愛軍,胡秀彩,石洪玥,邢克智.  江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2019(18)
[4]即食米面制品中蠟樣芽胞桿菌分離鑒定及毒力基因研究[J]. 張明明,梁美丹,肖劍,張彬彬,蔣佳希,宋安華.  食品工業(yè)科技. 2019(22)
[5]馬源蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定及毒力基因檢測[J]. 崔一龍,石蕓,楊達(dá)漢,尹有勤,薛江東,霍曉偉,馬德慧.  浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2019(02)
[6]食品中蠟樣芽孢桿菌的分離及攜帶毒力基因的檢測[J]. 白鳳嵐,陳松,羅夢幽,曾寶鋒,唐俊妮.  現(xiàn)代食品科技. 2018(10)
[7]蠟樣芽孢桿菌檢測方法研究進(jìn)展[J]. 黃晶菁,羅靜,何宏軒.  中國畜牧獸醫(yī). 2018(03)
[8]半滑舌鰨源蠟樣芽孢桿菌毒性檢測及藥敏試驗(yàn)[J]. 王琰,高四合,單建杰,羅璋,劉金蘭.  水產(chǎn)科學(xué). 2018(01)
[9]棘胸蛙致病性蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定及病理組織觀察[J]. 呂耀平,金晶,施倩,陳潔,劉子明,陸君,黃富友,傅旭豪.  水生生物學(xué)報. 2018(01)
[10]生鮮食品中蠟樣芽孢桿菌毒力基因及耐藥性研究[J]. 田萬帆,張榮,龍虎,柳琳,賀蘇皖,杜玄,蔣敏,趙悅,唐俊妮.  食品工業(yè)科技. 2018(06)

碩士論文
[1]豬源蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定[D]. 趙振宇.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014



本文編號：3237899