發(fā)布時(shí)間：2021-06-15 10:14

　　HBD-2-haFGF是一種具有痤瘡治療作用的新型融合蛋白。為提高重組大腸埃希菌Escherichia coli BL21 （DE3）/pET-21b-hBD-2-haFGF中hBD-2-haFGF基因的表達(dá)水平,本研究嘗試優(yōu)化其誘導(dǎo)表達(dá)條件。分別選取IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、培養(yǎng)基pH和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn),在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),以蛋白表達(dá)量作為考察指標(biāo)。經(jīng)過響應(yīng)面分析,響應(yīng)面二次回歸方程為y=55.33-1.59A+0.754B+0.26C+6.33D-0.56AB+5.42AC+9.66AD-2.12BC-0.93BD-2.84CD-4.73A²-8.11B²-1.74C²-4.33D²。BL21（DE3）/pET-21b-hBD-2-haFGF的最優(yōu)表達(dá)條件為:誘導(dǎo)溫度39.52℃,IPTG濃度0.60 mmol/L,pH值7.95,時(shí)間3 h,預(yù)期灰度值為62.893。通過本研究可為進(jìn)一步大量誘導(dǎo)制備、純化hBD-2-haFGF蛋白提供技術(shù)支持。 

【文章來源】：基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2020,39(08)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

各因素對hBD-2-haFGF表達(dá)的影響

在目前的痤瘡治療中，抗菌治療和抑制瘢痕生成是兩個(gè)重要的治療方向。為此，在前期構(gòu)建和表達(dá)了具有抗菌和抑制瘢痕生成的雙功能重組蛋白h BD-2-ha FGF。h BD-2是一種來源于皮膚、呼吸道等上皮組織的陽離子抗菌肽。帶正電荷的h BD-2可與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性受到破壞，胞內(nèi)容物外泄，導(dǎo)致菌體死亡。在痤瘡病損部位，皮脂腺痤瘡丙酸桿菌為h BD-2的主要誘導(dǎo)源，可刺激皮脂腺細(xì)胞產(chǎn)生抗菌肽和h BD-2。ha FGF是成纖維細(xì)胞生長因子家族成員之一()。ha FGF能主動與傷口附近細(xì)胞膜上的特異性受體相結(jié)合，誘導(dǎo)傷口附近細(xì)胞分裂、增殖，促進(jìn)皮膚和粘膜創(chuàng)面愈合并減少疤痕收縮和皮膚的畸形增生，快速高效修復(fù)創(chuàng)傷。在針對痤瘡的臨床治療中，hb FGF聯(lián)合點(diǎn)陣鉺激光、微晶磨面等，促進(jìn)痤瘡瘢痕創(chuàng)面的愈合()。相對于hb FGF,ha FGF結(jié)合能力更強(qiáng)，更適合創(chuàng)面酸性環(huán)境，更為溫和持久的生物學(xué)活性，在痤瘡中可取得更佳的治療效果()。通過基因工程可在體外大量發(fā)酵制備活性蛋白，但是發(fā)酵過程中蛋白的表達(dá)受諸多因素的影響，如培養(yǎng)基p H值、溫度、IPTG濃度、時(shí)間、搖瓶體積和發(fā)酵時(shí)機(jī)等，此外多種因素之間還存在交互影響，簡單的單因素實(shí)驗(yàn)并不能達(dá)到預(yù)期的效果，正交試驗(yàn)注重于科學(xué)的安排試驗(yàn)，尋找最佳的因素水平組合，但考慮因素之間的交互作用時(shí)，試驗(yàn)次數(shù)將顯著增加(王艷等,2008,分析試驗(yàn)室,27(z2):333-334)。

通過基因工程可在體外大量發(fā)酵制備活性蛋白，但是發(fā)酵過程中蛋白的表達(dá)受諸多因素的影響，如培養(yǎng)基p H值、溫度、IPTG濃度、時(shí)間、搖瓶體積和發(fā)酵時(shí)機(jī)等，此外多種因素之間還存在交互影響，簡單的單因素實(shí)驗(yàn)并不能達(dá)到預(yù)期的效果，正交試驗(yàn)注重于科學(xué)的安排試驗(yàn)，尋找最佳的因素水平組合，但考慮因素之間的交互作用時(shí)，試驗(yàn)次數(shù)將顯著增加(王艷等,2008,分析試驗(yàn)室,27(z2):333-334)。響應(yīng)面法最早由英國科學(xué)家Box和Wilson提出，隨后迅速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、食品學(xué)及醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域(田泱源和李瑞芳,2010)。響應(yīng)面法是利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的綜合試驗(yàn)技術(shù)解決復(fù)雜系統(tǒng)輸入與輸出之間關(guān)系的一種方法，通過有限的試驗(yàn)次數(shù)建立各顯著因素的一次項(xiàng)、平方項(xiàng)和因素之間交互作用項(xiàng)的數(shù)學(xué)模型，通過對函數(shù)響應(yīng)面和等高線的分析，確定多因素系統(tǒng)的最佳條件(李莉等,2015)。響應(yīng)面法相對于單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短和精度高的優(yōu)點(diǎn)，不僅考慮各因素對響應(yīng)值的影響，還考慮因素之間的相互作用對響應(yīng)值的影響(何佳鮮等,2017)。前期研究發(fā)現(xiàn)IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、培養(yǎng)基p H值和誘導(dǎo)時(shí)間均對h BD-2-ha FGF的表達(dá)產(chǎn)生影響較大，在進(jìn)一步的研究中選擇了這4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)確定了各因素的最優(yōu)水平。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化。本研究中，p H值和溫度兩個(gè)單因素可以顯著影響h BD-2-ha FGF的產(chǎn)量，溫度對重組蛋白的產(chǎn)量影響顯著，低溫會增加可溶性蛋白的比例，但降低蛋白的產(chǎn)量，較高的溫度可以提高蛋白的產(chǎn)量(吳桐等,2016)，但過高的溫度會導(dǎo)致大腸埃希菌的生長不適從而導(dǎo)致產(chǎn)量下降(黃孔威,2018)。在不同的文獻(xiàn)報(bào)道中p H對蛋白產(chǎn)量的影響并不統(tǒng)一，這可能與蛋白的本身性質(zhì)有關(guān)(張盛等,2008)，在本研究中，h BD-2-ha FGF在偏堿性環(huán)境下產(chǎn)量更高。時(shí)間-p H、時(shí)間-IPTG、時(shí)間-溫度、p H-p H、時(shí)間-時(shí)間、溫度-溫度等交互因素均能對蛋白的表達(dá)具有顯著影響，響應(yīng)面圖顯示等高線呈現(xiàn)橢圓形。通過對回歸方程的求解得到最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度39.52℃，IPTG濃度0.60 mmol/L,p H值7.95，時(shí)間3 h。通過本研究，為能大規(guī)模發(fā)酵制備h BD-2-ha FGF提供了理論依據(jù)。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3230868