目的:探討短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA）靶向沉默切除修復(fù)交叉互補基因組1（ERCC1）對不同濃度順鉑處理的肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP增殖和凋亡的影響。方法:設(shè)計并合成靶向人的ERCC1基因shRNA;采用脂質(zhì)體lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入A549/DDP細(xì)胞,通過Real-time PCR和Western Blot分別檢測轉(zhuǎn)染前后ERCC1 mRNA和蛋白表達(dá);MTT法檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞增殖抑制率的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果:成功構(gòu)建ERCC1-shRNA并轉(zhuǎn)入A549/DDP,ERCC1-shRNA有效抑制ERCC1mRNA和蛋白表達(dá)（P<0.05）。與陰性對照組和空白對照組比較,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞ERCC1增殖抑制率明顯升高,IC50值明顯下降,細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,細(xì)胞凋亡率增高（P<0.05）。結(jié)論:ERCC1-shRNA能有效沉默A549/DDP細(xì)胞中ERCC1基因的表達(dá),細(xì)胞增殖顯著受抑而凋亡明顯增強。 

【文章來源】：皖南醫(yī)學(xué)院安徽省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

Westernblotting檢測

26與陰性對照組和空白對照組比較，##，** P<0.01 3 轉(zhuǎn)染后 A549/DDP 細(xì)胞 ERCC1 蛋白表達(dá)情況gure3 The expressions of ERCC1 proteins in transfected A549/DDP c MTT 法檢測轉(zhuǎn)染后 A549/DDP 對順鉑半數(shù)抑制量的變篩選干擾目的基因效率較高的ERCC1-shRNA1組行MTT檢測，A549h后,用MTT法檢測shRNA1轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組在不同存活率的變化(順鉑終濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3.12驗重復(fù)三次。結(jié)果表明，A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA1 48h后，與陰

空白對照組 (71.75 ± 4.56) (27.13±3.24)與陰性對照組與空白對照組比較，* P<0.05圖5 流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染ERCC1-shRNA后各組A549/DDP細(xì)胞周期變化Figure5 Effects of transfected ERCC1-shRNA on the cell cycles of the A549/DDP cells5 ERCC1-shRNA1 可促進(jìn)細(xì)胞凋亡A549/DDP 細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染 24h 后,分別加入 0、6.25μg/ml 順鉑作用 48h 后,按實驗分組收集細(xì)胞,用標(biāo)記了 FITC 的 AnnexinV 作為焚光探針在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡,實驗重復(fù)三次。在流式細(xì)胞儀雙變量的散點圖上,左下象限（LL）表示活細(xì)胞的數(shù)目,為(FITC-/PI-)，左上象限（UL）表示細(xì)胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞的數(shù)目，右下象限（LR）為早期調(diào)亡細(xì)胞的數(shù)目,為(FITC+/PI-)，右上象限（UR）表示晚期調(diào)亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的數(shù)目,為(FITC+/PI+ )。通常細(xì)胞調(diào)亡率用 UR+LR表示,本實驗流式細(xì)胞儀分析結(jié)果提示 ERCC1-shRNA1 可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。順鉑濃度陰性對照組 ERCC1-shRNA1 組 空白對照組

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3230443