發(fā)布時間：2021-06-05 16:48

　　多年生黑麥草（Lolium perenne L.）是具有生長快、分蘗多、耐牧、成坪速度快等優(yōu)點的高價值飼用牧草。但因其籽粒小、飽滿度差,嚴重降低了種子收獲指數(shù)和種子質量,是全球范圍內長期制約規(guī)�；N子生產(chǎn)效率的重要因素。CRISPR/Cas9基因編輯技術能夠實現(xiàn)對基因的定點編輯,可作為黑麥草通過基因工程手段進行種質創(chuàng)新的有力工具。然而,由于多年生黑麥草遺傳轉化體系尚不成熟且遠遠滯后于其他作物,為通過基因編輯對其進行定向改良帶來困難。因此,建立高效遺傳轉化體系并通過CRISPR/Cas9技術對黑麥草種子產(chǎn)量潛力進行遺傳改良,對于保證黑麥草種子生產(chǎn)和機械化收獲均具有重要意義。本研究建立了新西蘭多年生黑麥草品種NUI的愈傷組織誘導及再生體系,克隆了LpCKX1全長基因序列并構建了靶向LpCKX1的CRISPR/Cas9基因編輯載體。為驗證編輯載體的效率,對黑麥草原生質體的制備及轉化條件進行了優(yōu)化。主要結果如下:1、多年生黑麥草愈傷組織的誘導及再生體系的建立采用多年生黑麥草NUI的成熟種子作外植體,建立了多年生黑麥草高效再生體系。其中橫切種子處理在添加5 mg/L的2,4-D的誘導培養(yǎng)基上,愈... 

【文章來源】：煙臺大學山東省

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

不同的愈傷組織類型注：A為Ⅰ類，B為Ⅱ類，C為Ⅲ類

第二章黑麥草愈傷組織的誘導及再生體系的建立18312表2.4愈傷組織誘導率情況Table2.4Callusinductionrate11111221121212112222122213113223123230.000.003.330.000.000.002.501.6710.001.255.832.5054.761.3311.670.835.173.6016.673.3320.003.7516.678.33711.113.6018.334.1715.5211.6728.3310.0031.6717.5028.8111.861420.638.6328.338.4022.4120.0050.0023.3351.6725.0043.4827.832126.9817.0031.6716.2527.5927.8354.1726.6759.1737.5044.3536.52注：1：接種天數(shù)（d）；2：誘導率（%）；3：接種方式Note:1:inoculationdays（d）;2:inductionrate（%）;3:inoculationmode圖2.2外植體處理組合131誘導的愈傷組織注：A:3天后出愈情況;B:14天后出愈情況;C:繼代兩次之后的愈傷組織Figure2.2Callusinduedviaexplanttreatmentcombination131Note:A:Callus3daysafterinoculation;B:Callus14daysafterinoculation;C:Callusaftertwosubcultures2.3.3不同濃度的6-BA對愈傷組織分化的影響將繼代2次以上的黑麥草胚性愈傷組織轉移到分化培養(yǎng)基上，在25℃、16h/d

第二章黑麥草愈傷組織的誘導及再生體系的建立20圖2.3黑麥草愈傷植株再生過程A,B愈傷組織分化出芽;C,D:生根的再生植株;E,F:移栽苗Figure2.3PlantregenerationinperennialryegrassA,B:Callusdifferentiatedshoots;C,D:Rootedplantlets;E,F:Transplantedplants2.4討論愈傷組織的誘導和分化是建立再生體系的兩個關鍵步驟，其過程主要依靠外源激素的添加來調節(jié)生長情況。通常在植物愈傷組織的誘導中添加生長素類似物2,4-D來進行調節(jié)，它是比較常見的植物生長激素，可以通過促進細胞分裂和細胞伸長來使植物愈創(chuàng)表面細胞產(chǎn)生增殖能力。在絕大多數(shù)草坪草愈傷組織的誘導中，2,4-D都是不可缺少的外源激素。在多年生黑麥草愈傷組織誘導中，通常添加一定量的2,4-D來對其生長情況進行調節(jié)。本研究結果表明，在誘導培養(yǎng)基中添加濃度為5mg/L的2,4-D能夠獲得狀態(tài)良好的胚性愈傷組織，且數(shù)量較多質量較好，能夠滿足后續(xù)的實驗要求。在不添加2,4-D的情況下，種子發(fā)芽較多且沒有愈傷組織產(chǎn)生，而隨著培養(yǎng)基中添加的2,4-D濃度逐漸升高，愈傷組織誘導率也逐漸升高且發(fā)芽較少，得到的胚性愈傷組織也越來越多，當達到5mg/L之后，愈傷組織誘導率也隨之慢慢下降且胚性愈傷組織數(shù)量減少，愈傷組織多成水漬狀極易褐化，表明過高的2,4-D濃度不利于

【參考文獻】：
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本文編號：3212540