多年生黑麥草（Lolium perenne L.）是具有生長快、分蘗多、耐牧、成坪速度快等優(yōu)點(diǎn)的高價(jià)值飼用牧草。但因其籽粒小、飽滿度差,嚴(yán)重降低了種子收獲指數(shù)和種子質(zhì)量,是全球范圍內(nèi)長期制約規(guī)�；N子生產(chǎn)效率的重要因素。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基因的定點(diǎn)編輯,可作為黑麥草通過基因工程手段進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新的有力工具。然而,由于多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不成熟且遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于其他作物,為通過基因編輯對(duì)其進(jìn)行定向改良帶來困難。因此,建立高效遺傳轉(zhuǎn)化體系并通過CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)黑麥草種子產(chǎn)量潛力進(jìn)行遺傳改良,對(duì)于保證黑麥草種子生產(chǎn)和機(jī)械化收獲均具有重要意義。本研究建立了新西蘭多年生黑麥草品種NUI的愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系,克隆了LpCKX1全長基因序列并構(gòu)建了靶向LpCKX1的CRISPR/Cas9基因編輯載體。為驗(yàn)證編輯載體的效率,對(duì)黑麥草原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。主要結(jié)果如下:1、多年生黑麥草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立采用多年生黑麥草NUI的成熟種子作外植體,建立了多年生黑麥草高效再生體系。其中橫切種子處理在添加5 mg/L的2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,愈... 

【文章來源】：煙臺(tái)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：91 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

不同的愈傷組織類型注：A為Ⅰ類，B為Ⅱ類，C為Ⅲ類

第二章黑麥草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立18312表2.4愈傷組織誘導(dǎo)率情況Table2.4Callusinductionrate11111221121212112222122213113223123230.000.003.330.000.000.002.501.6710.001.255.832.5054.761.3311.670.835.173.6016.673.3320.003.7516.678.33711.113.6018.334.1715.5211.6728.3310.0031.6717.5028.8111.861420.638.6328.338.4022.4120.0050.0023.3351.6725.0043.4827.832126.9817.0031.6716.2527.5927.8354.1726.6759.1737.5044.3536.52注：1：接種天數(shù)（d）；2：誘導(dǎo)率（%）；3：接種方式Note:1:inoculationdays（d）;2:inductionrate（%）;3:inoculationmode圖2.2外植體處理組合131誘導(dǎo)的愈傷組織注：A:3天后出愈情況;B:14天后出愈情況;C:繼代兩次之后的愈傷組織Figure2.2Callusinduedviaexplanttreatmentcombination131Note:A:Callus3daysafterinoculation;B:Callus14daysafterinoculation;C:Callusaftertwosubcultures2.3.3不同濃度的6-BA對(duì)愈傷組織分化的影響將繼代2次以上的黑麥草胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，在25℃、16h/d

第二章黑麥草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立20圖2.3黑麥草愈傷植株再生過程A,B愈傷組織分化出芽;C,D:生根的再生植株;E,F:移栽苗Figure2.3PlantregenerationinperennialryegrassA,B:Callusdifferentiatedshoots;C,D:Rootedplantlets;E,F:Transplantedplants2.4討論愈傷組織的誘導(dǎo)和分化是建立再生體系的兩個(gè)關(guān)鍵步驟，其過程主要依靠外源激素的添加來調(diào)節(jié)生長情況。通常在植物愈傷組織的誘導(dǎo)中添加生長素類似物2,4-D來進(jìn)行調(diào)節(jié)，它是比較常見的植物生長激素，可以通過促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長來使植物愈創(chuàng)表面細(xì)胞產(chǎn)生增殖能力。在絕大多數(shù)草坪草愈傷組織的誘導(dǎo)中，2,4-D都是不可缺少的外源激素。在多年生黑麥草愈傷組織誘導(dǎo)中，通常添加一定量的2,4-D來對(duì)其生長情況進(jìn)行調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果表明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加濃度為5mg/L的2,4-D能夠獲得狀態(tài)良好的胚性愈傷組織，且數(shù)量較多質(zhì)量較好，能夠滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求。在不添加2,4-D的情況下，種子發(fā)芽較多且沒有愈傷組織產(chǎn)生，而隨著培養(yǎng)基中添加的2,4-D濃度逐漸升高，愈傷組織誘導(dǎo)率也逐漸升高且發(fā)芽較少，得到的胚性愈傷組織也越來越多，當(dāng)達(dá)到5mg/L之后，愈傷組織誘導(dǎo)率也隨之慢慢下降且胚性愈傷組織數(shù)量減少，愈傷組織多成水漬狀極易褐化，表明過高的2,4-D濃度不利于

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]小麥常規(guī)育種與分子育種的結(jié)合探討[J]. 仲敏.  農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備. 2019(10)
[2]多年生黑麥草分子標(biāo)記應(yīng)用及基因組研究進(jìn)展[J]. 劉曉強(qiáng),趙海濱,李新玲,張延明.  分子植物育種. 2020(02)
[3]玉米葉片原生質(zhì)體的制備及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 雷海英,白鳳麟,馮宇,郭亞沖,喬楠茜.  長治學(xué)院學(xué)報(bào). 2018(02)
[4]基因編輯技術(shù)[J]. 胡小丹,游敏,羅文新.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2018(03)
[5]植物原生質(zhì)體分離方法及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 常勝合,孫威,許桂鶯,王展,銀曼妮,韓謙,魏卿,李敬陽,舒海燕.  分子植物育種. 2018(04)
[6]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物育種中的應(yīng)用[J]. 趙波,張余,張雨良.  熱帶作物學(xué)報(bào). 2018(01)
[7]油桐葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離及瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 谷戰(zhàn)英,楊若楠,陳昊.  林業(yè)科學(xué). 2018(01)
[8]PEG介導(dǎo)的柳枝稷葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系的建立[J]. 祁澤文,孫鑫博,樊波,張雪,袁建波,韓烈保.  草業(yè)學(xué)報(bào). 2017(09)
[9]多花黑麥草特高和多年生黑麥草四季高頻組培再生體系的優(yōu)化與建立[J]. 曾慶飛,韋鑫,陳錫,陳光潔,馬培杰,吳佳海,王小利.  草業(yè)科學(xué). 2017(08)
[10]禾谷類作物原生質(zhì)體培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 郝艷芳,王良群,劉勇,張微,楊偉,白鴻雁,武擘.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2016(35)

博士論文
[1]日本結(jié)縷草（Zoysia japonica Steud.）懸浮再生體系的建立與超低溫保存研究[D]. 方文娟.北京林業(yè)大學(xué) 2008
[2]幾種牧草和草坪草植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其轉(zhuǎn)基因研究[D]. 張振霞.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2002

碩士論文
[1]馬鈴薯原生質(zhì)體培養(yǎng)再生及利用CRISPR/Cas9瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的研究[D]. 李曉.內(nèi)蒙古大學(xué) 2019
[2]多年生黑麥草的抗旱性與基因多樣性及干旱基因表達(dá)的關(guān)系[D]. 崔瑜.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]大豆瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與應(yīng)用[D]. 徐坤.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2014
[4]多年生黑麥草離體再生體系及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D]. 余斌.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[5]多年生黑麥草高頻再生體系的建立及農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化因素的初步研究[D]. 梁華.西南大學(xué) 2009
[6]黑麥草離體再生體系的建立和基因槍法介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究[D]. 何近剛.西北大學(xué) 2007
[7]幾種草坪草的組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D]. 許瑾.山西大學(xué) 2006
[8]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑麥草叢生芽芽尖的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株再生[D]. 姜素云.山東大學(xué) 2005



本文編號(hào)：3212540