本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)hCD47基因豬的創(chuàng)建及其在異種移植中抗吞噬作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：異種器官移植是解決供體器官短缺的有效途徑,豬因其器官大小、生理功能與人更為接近,被認為是人類異種器官移植的理想供體。然而,異種移植物進入受體后將被受體巨噬細胞清除,其主要原因是巨噬細胞表面的受體-信號調(diào)節(jié)蛋白α(singal regulatory proteinα,SIRPα)不能特異地識別異種細胞表面的整合素相關(guān)蛋白CD47(integrin associated protein,IAP),導致移植物細胞被受體內(nèi)的巨噬細胞吞噬并清除。本研究在敲除α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因(α-1,3-galactosyltransferase knockout,GTKO)的巴馬小型豬的基礎(chǔ)上,轉(zhuǎn)入人CD47(hCD47)基因,制備GTKO/hCD47基因修飾豬,以期避免超急性排斥反應并減弱受體巨噬細胞對移植物細胞的吞噬。本研究構(gòu)建廣泛性表達啟動子CAG調(diào)控的hCD47基因表達載體p CAGGS-hCD47-Neo,轉(zhuǎn)染GTKO巴馬小型豬的耳成纖維細胞,通過體細胞克隆技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因克隆豬。利用PCR技術(shù)對克隆仔豬進行轉(zhuǎn)基因鑒定,同時通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、Western Blot及免疫組化方法分析hCD47在轉(zhuǎn)基因豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰腺等組織中的表達。抽取存活仔豬血液進行生理指標檢測,監(jiān)測其健康狀況。采用密度梯度離心法分離轉(zhuǎn)基因豬的骨髓間充質(zhì)干細胞(porcine bone marrow mesenchymal stem cells,pMSCs),利用流式細胞術(shù)檢測pMSCs細胞表面標志CD29、CD34、CD44、CD45和CD90的表達。使用CFSE標記豬外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),并通過流式細胞術(shù)檢測豬PBMC與人巨噬細胞體外共孵育后的剩余率,以檢測hCD47基因在抗巨噬細胞吞噬中的作用。上述研究結(jié)果具體如下:1.使用內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ對hCD47基因表達載體pCAGGS-hCD47-Neo進行酶切驗證及測序檢測,結(jié)果表明載體pCAGGS-hCD47-Neo中各組成元件序列均正確。使用構(gòu)建完成的hCD47基因表達載體體外轉(zhuǎn)染豬耳成纖維細胞,24h后進行RT-PCR及Western Blot檢測,結(jié)果表明,hCD47基因在耳成纖維細胞中具有明顯的RNA及蛋白水平的表達。2.使用pCAGGS-hCD47-Neo載體轉(zhuǎn)染豬耳成纖維細胞,通過G418篩選后共獲得46個單細胞克隆,通過體細胞核移植獲得重構(gòu)胚,移植647枚胚胎到4頭受體母豬。4頭受體均妊娠至終期并自然產(chǎn)仔13頭,經(jīng)PCR鑒定顯示13頭仔豬均為陽性。3.通過qRT-PCR檢測hCD47基因在轉(zhuǎn)基因克隆仔豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰腺等主要組織、器官中的表達。結(jié)果表明,hCD47基因在胰腺中的表達水平最高,其次分別為肝臟、肺臟、脾臟和腎臟,在心臟中的表達水平最低。4.通過對轉(zhuǎn)基因克隆仔豬的心臟、肝臟和胰腺等組織樣進行免疫組化及Western Blot檢測,結(jié)果表明hCD47基因在胰腺及肝臟組織中具有明顯的表達。5.通過對出生3個月、6個月的仔豬進行血液生理指標檢測,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)hCD47基因克隆仔豬各項血液生理指標均符合文獻報道的巴馬小型豬血液生理指標參考范圍,并與野生型巴馬小型豬血液生理指標無顯著差異(p0.05)。6.通過流式細胞術(shù)對pMSCs細胞表面標志進行檢測,結(jié)果顯示,pMSCs細胞表達CD29、CD44和CD90等標志,不表達CD34、CD45等標志。7.通過流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)hCD47基因豬的PBMC細胞及pMSCs細胞中hCD47的表達,結(jié)果顯示,PBMC細胞及pMSCs細胞明顯表達hCD47。8.THP-1來源的人巨噬細胞與豬PBMC細胞體外共孵育結(jié)果顯示:表達hCD47基因的豬PBMC細胞在THP-1來源的人巨噬細胞中的存活率顯著高于不表達hCD47基因的豬PBMC細胞(p0.05)。綜上所述,本研究成功制備了表達hCD47基因的GTKO巴馬小型豬,明確了hCD47基因在主要組織和細胞中的表達,初步驗證了hCD47基因在抗人巨噬細胞吞噬中的作用,為探究hCD47基因在減弱受體巨噬細胞對異種移植物的排斥反應中的作用提供模型。
【關(guān)鍵詞】：hCD47基因 異種移植 巨噬細胞 基因表達 巴馬小型豬
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;R392.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• SUMMARY6-8
• 英文縮略表8-9
• 第一部分 文獻綜述9-16
• 1 CD47分子的基本特性9-10
• 1.1 CD47的發(fā)現(xiàn)9-10
• 1.2 CD47結(jié)構(gòu)與分布10
• 2 CD47分子與整合素、TSP-1 及SIRPα 之間的相互作用10-13
• 2.1 CD47與整合素分子10-11
• 2.2 CD47與TSP-111
• 2.3 CD47與SIRPα11-13
• 3 CD47在移植領(lǐng)域中的研究13-15
• 3.1 CD47在移植中的研究13-14
• 3.2 CD47與免疫耐受14-15
• 4 研究目的及意義15-16
• 第二部分 廣泛性表達hCD47轉(zhuǎn)基因克隆豬制備16-35
• 1 實驗材料16-20
• 1.1 動物性材料16
• 1.2 主要試劑及實驗耗材16-17
• 1.3 主要儀器設(shè)備17-18
• 1.4 溶液的配制18-20
• 2 方法20-27
• 2.1 表達載體pCAGGS-hCD47-Neo的構(gòu)建及鑒定20-22
• 2.1.1 表達載體pCAGGS-hCD47-Neo的構(gòu)建20-21
• 2.1.2 載體pCAGGS-hCD47-Neo的鑒定21-22
• 2.2 陽性克隆點細胞轉(zhuǎn)染、篩選及鑒定22-23
• 2.2.1 供體細胞的轉(zhuǎn)染22
• 2.2.2 陽性克隆點細胞篩選22
• 2.2.3 陽性細胞鑒定22-23
• 2.3 轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的重構(gòu)及胚胎移植23-24
• 2.3.1 轉(zhuǎn)基因胚胎的重構(gòu)23
• 2.3.2 胚胎移植和妊娠檢測23-24
• 2.4 轉(zhuǎn)hCD47基因仔豬鑒定24-26
• 2.4.1 DNA整合鑒定24
• 2.4.2 qRT-PCR分析24-25
• 2.4.3 Western Blot檢測25
• 2.4.4 免疫組化檢測25-26
• 2.5 仔豬血液生理指標檢測26-27
• 3 結(jié)果與分析27-34
• 3.1 pCAGGS-hCD47-Neo載體酶切鑒定27-28
• 3.2 陽性克隆點細胞RT-PCR鑒定28
• 3.3 陽性克隆點細胞GGTA1基因流式分析28-29
• 3.4 轉(zhuǎn)基因克隆胚胎移植后的體內(nèi)發(fā)育29-30
• 3.5 仔豬DNA整合鑒定30
• 3.6 qRT-PCR檢測各組織hCD47基因的表達30-31
• 3.7 Western Blot及免疫組化檢測31-32
• 3.8 仔豬血液生理指標檢測32-34
• 4 討論34-35
• 第三部分 轉(zhuǎn)hCD47基因豬的功能研究35-44
• 1 實驗材料35-37
• 1.1 動物性材料35
• 1.2 主要試劑及實驗耗材35-36
• 1.3 主要儀器設(shè)備36
• 1.4 溶液的配制36-37
• 2 方法37-39
• 2.1 轉(zhuǎn)基因克隆豬pMSCS細胞的分離37
• 2.2 pMSCS細胞表面分子標志鑒定37-38
• 2.3 pMSCS及PBMC細胞hCD47的流式檢測38
• 2.4 豬PBMC細胞剩余量檢測38-39
• 2.4.1 豬PBMC細胞分離38
• 2.4.2 CFSE標記PBMC細胞38-39
• 2.4.3 THP-1 細胞誘導分化39
• 2.4.4 人巨噬細胞與豬PBMC體外共孵育39
• 3 結(jié)果與分析39-42
• 3.1 pMSCS細胞的體外培養(yǎng)39-40
• 3.2 pMSCS細胞表面標志測定40-41
• 3.3 轉(zhuǎn)基因克隆豬pMSCS及PBMC細胞上hCD47的流式分析41-42
• 3.4 豬PBMC細胞剩余量檢測結(jié)果及分析42
• 4 討論42-44
• 第四部分 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-51
• 致謝51-52
• 作者簡介52-53
• 導師簡介53-54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)hCD47基因豬的創(chuàng)建及其在異種移植中抗吞噬作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：317266