血紅素（heme）是一種重要的鐵卟啉化合物,參與生物體內包括鐵運輸、抗氧化、信號調控以及多數(shù)血紅素蛋白形成等生物功能。本論文以大腸桿菌（Escherichia coli）作為研究對象,以探究血紅素合成途徑中關鍵酶基因表達對終產物合成的調控為目標,通過轉錄組學對重組菌血紅素合成的機理進行分析,并通過促進血紅素合成的基因與芥藍抗壞血酸過氧化物酶基因（apx）的共表達,增加內源血紅素含量提高了過氧化物酶的活力。主要研究結果如下:（1）關鍵酶基因的過表達與環(huán)境因素對大腸桿菌血紅素合成的調控。通過構建含有gltX、hemA、hemB、hemD、hemH和hemAD基因的同源重組大腸桿菌Eco/pEX、Eco/pEA、Eco/pEB、Eco/pED、Eco/pEH和Eco/pEAD,發(fā)現(xiàn)hemA基因對血紅素卟啉的合成有明顯的促進作用,Eco/pEA血紅素產量可達26.53μmmol·^-1,比對照組提升了8.08倍。而其他基因的過表達及hemA和hemD的共表達無明顯效果。通過溫度、溶氧及外源添加物對卟啉合成前體5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid,5-... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：47 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 血紅素簡介
        1.1.1 血紅素的結構特征
        1.1.2 血紅素的生理功能與應用
        1.1.3 以血紅素為輔基的過氧化物酶
    1.2 血紅素的合成途徑
    1.3 大腸桿菌血紅素合成途徑的研究進展
    1.4 立題意義與主要研究內容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 質粒與菌株
        2.1.4 培養(yǎng)基及常用溶液配制
    2.2 血紅素合成途徑關鍵酶基因過表達方法
        2.2.1 重組單質粒的構建
        2.2.2 重組質粒的轉化
        2.2.3 雙基因共表達質粒的構建
        2.2.4 重組質粒的鑒定
    2.3 關鍵酶基因重組菌的表達與檢測
        2.3.1 重組蛋白表達及SDS-PAGE檢測
        2.3.2 卟啉血紅素濃度檢測
        2.3.3 環(huán)境因素的設置
        2.3.4 5-ALA檢測
    2.4 RNA-seq與qRT-PCR分析方法
        2.4.1 RNA-seq分析方法
        2.4.3 qRT-PCR分析方法
    2.5 過氧化物酶的制備與檢測
        2.5.1 重組酶的制備
        2.5.2 APX酶活檢測
第三章 結果與討論
    3.1 關鍵酶基因的過表達與環(huán)境因素對大腸桿菌血紅素合成的調控
        3.1.1 表達菌株的構建
        3.1.2 單基因的表達及其對卟啉合成的影響
        3.1.3 hemA與hemD共表達及其對卟啉合成的影響
        3.1.4 環(huán)境因素對Eco/pEA中5-ALA及血紅素產量影響
        3.1.5 小結
    3.2 重組菌血紅素合成機理分析
        3.2.1 誘導劑濃度對Eco/pEA的GluTR蛋白表達和5-ALA產量的影響
        3.2.2 不同誘導條件下血紅素合成途經的基因差異表達
        3.2.3 不同誘導條件下血紅素合成相關的基因差異表達
        3.2.4 不同誘導條件下對其他代謝途徑的影響
        3.2.5 RNA-seq驗證與其他關鍵酶的轉錄分析
        3.2.6 小結
    3.3 共表達hemA和APX酶基因提高過氧化物酶APX酶活
        3.3.1 共表達體系的構建
        3.3.2 共表達體系重組酶的誘導表達
        3.3.3 共表達體系重組酶APX的酶活分析
        3.3.4 小結
主要結論及展望
致謝
參考文獻
附錄：作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文



本文編號：3166560