血紅素（heme）是一種重要的鐵卟啉化合物,參與生物體內(nèi)包括鐵運(yùn)輸、抗氧化、信號調(diào)控以及多數(shù)血紅素蛋白形成等生物功能。本論文以大腸桿菌（Escherichia coli）作為研究對象,以探究血紅素合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)對終產(chǎn)物合成的調(diào)控為目標(biāo),通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)對重組菌血紅素合成的機(jī)理進(jìn)行分析,并通過促進(jìn)血紅素合成的基因與芥藍(lán)抗壞血酸過氧化物酶基因（apx）的共表達(dá),增加內(nèi)源血紅素含量提高了過氧化物酶的活力。主要研究結(jié)果如下:（1）關(guān)鍵酶基因的過表達(dá)與環(huán)境因素對大腸桿菌血紅素合成的調(diào)控。通過構(gòu)建含有g(shù)ltX、hemA、hemB、hemD、hemH和hemAD基因的同源重組大腸桿菌Eco/pEX、Eco/pEA、Eco/pEB、Eco/pED、Eco/pEH和Eco/pEAD,發(fā)現(xiàn)hemA基因?qū)ρt素卟啉的合成有明顯的促進(jìn)作用,Eco/pEA血紅素產(chǎn)量可達(dá)26.53μmmol·^-1,比對照組提升了8.08倍。而其他基因的過表達(dá)及hemA和hemD的共表達(dá)無明顯效果。通過溫度、溶氧及外源添加物對卟啉合成前體5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid,5-... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：47 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 血紅素簡介
        1.1.1 血紅素的結(jié)構(gòu)特征
        1.1.2 血紅素的生理功能與應(yīng)用
        1.1.3 以血紅素為輔基的過氧化物酶
    1.2 血紅素的合成途徑
    1.3 大腸桿菌血紅素合成途徑的研究進(jìn)展
    1.4 立題意義與主要研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 質(zhì)粒與菌株
        2.1.4 培養(yǎng)基及常用溶液配制
    2.2 血紅素合成途徑關(guān)鍵酶基因過表達(dá)方法
        2.2.1 重組單質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        2.2.3 雙基因共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.4 重組質(zhì)粒的鑒定
    2.3 關(guān)鍵酶基因重組菌的表達(dá)與檢測
        2.3.1 重組蛋白表達(dá)及SDS-PAGE檢測
        2.3.2 卟啉血紅素濃度檢測
        2.3.3 環(huán)境因素的設(shè)置
        2.3.4 5-ALA檢測
    2.4 RNA-seq與qRT-PCR分析方法
        2.4.1 RNA-seq分析方法
        2.4.3 qRT-PCR分析方法
    2.5 過氧化物酶的制備與檢測
        2.5.1 重組酶的制備
        2.5.2 APX酶活檢測
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 關(guān)鍵酶基因的過表達(dá)與環(huán)境因素對大腸桿菌血紅素合成的調(diào)控
        3.1.1 表達(dá)菌株的構(gòu)建
        3.1.2 單基因的表達(dá)及其對卟啉合成的影響
        3.1.3 hemA與hemD共表達(dá)及其對卟啉合成的影響
        3.1.4 環(huán)境因素對Eco/pEA中5-ALA及血紅素產(chǎn)量影響
        3.1.5 小結(jié)
    3.2 重組菌血紅素合成機(jī)理分析
        3.2.1 誘導(dǎo)劑濃度對Eco/pEA的GluTR蛋白表達(dá)和5-ALA產(chǎn)量的影響
        3.2.2 不同誘導(dǎo)條件下血紅素合成途經(jīng)的基因差異表達(dá)
        3.2.3 不同誘導(dǎo)條件下血紅素合成相關(guān)的基因差異表達(dá)
        3.2.4 不同誘導(dǎo)條件下對其他代謝途徑的影響
        3.2.5 RNA-seq驗(yàn)證與其他關(guān)鍵酶的轉(zhuǎn)錄分析
        3.2.6 小結(jié)
    3.3 共表達(dá)hemA和APX酶基因提高過氧化物酶APX酶活
        3.3.1 共表達(dá)體系的構(gòu)建
        3.3.2 共表達(dá)體系重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3.3 共表達(dá)體系重組酶APX的酶活分析
        3.3.4 小結(jié)
主要結(jié)論及展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄：作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文



本文編號：3166560