本文關(guān)鍵詞：KR3和Hs1基因聚合對大豆花葉病毒病抗性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：大豆(Glycine max(L.)Merr.)是重要的油料作物和高蛋白糧飼兼用作物。大豆花葉病毒病分布十分廣泛不僅是一種世界性病害,而且也是南方地區(qū)常見的大豆病害之一。大豆花葉病毒在大豆種植過程都會(huì)危害大豆,不僅影響大豆產(chǎn)量,還會(huì)影響大豆質(zhì)量,會(huì)造成病株籽粒出現(xiàn)褐斑,嚴(yán)重降低大豆商品質(zhì)量。花葉病毒防治常采用種植抗性品種,但抗性品種的選育是一個(gè)長期過程且品種抗性會(huì)隨著花葉病毒生理小種的改變而喪失。利用基因工程技術(shù)在植物基因組中導(dǎo)入植物抗病基因是植物抗病毒病育種中一條十分有效的途徑。植物中抗病基因在受到病原物侵染時(shí)通過直接或間接地與病毒產(chǎn)物作用來識別病原體產(chǎn)生反應(yīng)信號,從而啟動(dòng)植物體內(nèi)的防御機(jī)制。KR3基因是大豆抗病基因,其編碼的氨基酸序列在結(jié)構(gòu)上與煙草抗花葉病毒N基因具有高度同源性,因此KR3基因可能具有抗花葉病毒的功能。KR3基因在結(jié)構(gòu)上也存在NBS、LRR、TIR等抗病基因具備的保守結(jié)構(gòu),含有抗病基因的保守序列,是NBS-LRR-TIR類抗病基因。Hs1pro-1是從野生甜菜中克隆的第一個(gè)胞囊線蟲抗性基因,是胞外富亮氨酸重復(fù)的跨膜蛋白和含有LRR保守序列。本實(shí)驗(yàn)利用分別連有KR3基因、Hs1pro-1基因的農(nóng)桿菌為表達(dá)載體,bar基因作為選擇標(biāo)記基因,以天隆一號為受體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行大豆遺傳轉(zhuǎn)化,共轉(zhuǎn)化624個(gè)外植體,獲得轉(zhuǎn)基因生根苗38株；通過草丁膦涂抹法、bar試紙條檢測法和PCR法鑒定,共獲得25株T0代轉(zhuǎn)基因陽性轉(zhuǎn)化植株,其中轉(zhuǎn)KR3基因陽性植株8株,轉(zhuǎn)Hslpro-1基因17株,平均轉(zhuǎn)化效率為3.89%,進(jìn)一步對T1代6株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern雜交檢測,結(jié)果表明K1、H1和H3株系為單拷貝株系,其余為多拷貝株系；以獲得的轉(zhuǎn)KR3基因和轉(zhuǎn)Hs1pro-1基因陽性植株為父母本,用傳統(tǒng)的雜交方法對其進(jìn)行雜交,共獲得9粒F1代雜交種子,播種通過雜交獲得的F1代雜交種子,1粒種子未能正常發(fā)芽,對其他F1代植株進(jìn)行PCR鑒定,結(jié)果顯示只有4號轉(zhuǎn)基因植株成功雜交；ELISA檢測結(jié)果表明,KR3、Hs1pro-1轉(zhuǎn)基因植株及KR3-Hsl基因聚合植株對花葉病毒具有一定的抗性,且KR3-Hs1基因聚合植株SMV抗性要強(qiáng)于大部分轉(zhuǎn)基因植株,而非轉(zhuǎn)基因則明顯感病。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明SMV接種前后轉(zhuǎn)基因不同株系基因表達(dá)量存在差異,在轉(zhuǎn)Hs1pro-1基因植株中,Hs1pro-1基因表達(dá)有所降低,而同時(shí)含KR3基因、Hs1Pro-1基因的聚合植株中KR3基因、Hs1pro-1基因表達(dá)均升高,說明兩個(gè)抗病基因同時(shí)存在能夠增強(qiáng)SMV抗性,根據(jù)防御基因PR1、PR3、OSM、EBF、ERF1、ERS2表達(dá)情況猜測在KR3-Hsl基因聚合植株中SA和JA/ET途徑可能存在相互協(xié)同作用表現(xiàn)對SMV的抗性,而在KR3、Hs1pro-1轉(zhuǎn)基因植株中抗病信號傳導(dǎo)主要由SA途徑完成；ELISA檢測結(jié)果表明,SA處理增強(qiáng)了非轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因植株對大豆花葉病毒的抗性,且轉(zhuǎn)基因植株的抗性比非轉(zhuǎn)基因植株強(qiáng)。SA處理后接種SMV轉(zhuǎn)基因大豆的熒光定量結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因不同株系KR3基因、Hs1Pro-1基因表達(dá)均有所降低,說明SA可能抑制了接種SMV轉(zhuǎn)基因植株中KR3基因、Hs1pro-1基因的表達(dá),由防御基因的表達(dá)推測SA處理后的抗SMV過程抗病信號傳導(dǎo)主要由JA/ET途徑完成。
【關(guān)鍵詞】：大豆 抗病基因 KR3基因 Hs1~(pro-1)基因 大豆花葉病毒
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.651
【目錄】：

• 致謝5-8
• 縮略圖表8-10
• 摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-28
• 1 大豆花葉病毒研究進(jìn)展14-16
• 1.1 大豆花葉病毒的分布與危害14-15
• 1.2 大豆花葉病毒的發(fā)病癥狀15
• 1.3 大豆花葉病毒的防治15-16
• 2 植物抗病基因研究進(jìn)展16-24
• 2.1 植物抗病基因結(jié)構(gòu)與分類19-21
• 2.1.1 胞囊線蟲抗性基因Hs1~(pro-1)的發(fā)現(xiàn)21
• 2.1.2 大豆抗性基因KR3的克隆21
• 2.2 植物抗性反應(yīng)21-24
• 2.2.1 早期識別21-22
• 2.2.2 信號組成22-23
• 2.2.3 防御相關(guān)蛋白23-24
• 2.2.4 SA在植物抗性反應(yīng)中的作用24
• 3 基因工程在大豆抗病中的應(yīng)用24-26
• 3.1 大豆抗病基因的克隆25
• 3.2 基因工程在大豆抗病育種的應(yīng)用25-26
• 4 本研究的目的和意義26-28
• 第二章 KR3、Hs1~(pro-1)、KR3-Hs1~(pro-1)基因大豆植株的獲得28-48
• 1 轉(zhuǎn)KR3基因、Hs1~(pro-1)基因大豆植株的獲得28-36
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料28-30
• 1.1.1 轉(zhuǎn)化受體28
• 1.1.2 供試質(zhì)粒和菌株28-29
• 1.1.3 試驗(yàn)試劑29-30
• 1.1.4 供試培養(yǎng)基30
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法30-36
• 1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法30-32
• 1.2.2 轉(zhuǎn)KR3基因、Hs1~(pro-1)基因植株的鑒定32-36
• 2 KR3-Hs1~(pro-1)聚合植株的獲得36-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料36
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法36-38
• 2.2.1 整體去雄雜交技術(shù)36-37
• 2.2.2 PCR法檢測37-38
• 2.2.3 RT-PCR檢測38
• 3 結(jié)果與分析38-44
• 3.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化體系的建立38-39
• 3.2 大豆遺傳轉(zhuǎn)化生根苗統(tǒng)計(jì)39
• 3.3 KR3基因和Hs1~(pro-1)基因轉(zhuǎn)化植株鑒定結(jié)果39-42
• 3.4 T_0代轉(zhuǎn)基因大豆遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果42
• 3.5 轉(zhuǎn)基因雜交結(jié)果42-43
• 3.6 轉(zhuǎn)基因雜交鑒定結(jié)果43-44
• 4 討論44-48
• 4.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法44-45
• 4.2 轉(zhuǎn)基因植株鑒定方法的比較45-46
• 4.3 大豆轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化效率研究46
• 4.4 大豆雜交技術(shù)研究46-48
• 第三章 KR3、Hs1、KR3-Hs1轉(zhuǎn)基因大豆花葉病毒抗性及防御基因表達(dá)48-64
• 1 材料與方法48-53
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料48-49
• 1.1.1 供試植株48
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑48-49
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法49-53
• 1.2.1 花葉病毒接種49
• 1.2.2 SA處理49
• 1.2.3 基因表達(dá)的測定49-53
• 1.2.4 花葉病毒DAS-ELISA檢測53
• 2 結(jié)果與分析53-61
• 2.1 SMV接種前后轉(zhuǎn)基因大豆KR3基因、Hs1基因相對表達(dá)量分析53-54
• 2.2 轉(zhuǎn)KR3、Hs1、KR3-Hs1基因植株大豆花葉病毒抗性測定54-55
• 2.3 SMV接種前后防御基因相對表達(dá)量分析55-58
• 2.4 SA處理SMV接種轉(zhuǎn)基因大豆KR3基因、Hs1基因相對表達(dá)量分析58
• 2.5 SA處理轉(zhuǎn)KR3、Hs1、KR3-Hs1基因植株大豆花葉病毒抗性測定58
• 2.6 SA處理SMV接種轉(zhuǎn)基因大豆防御基因相對表達(dá)量分析58-61
• 3 討論61-64
• 3.1 轉(zhuǎn)基因植株基因表達(dá)與SMV抗性分析61-62
• 3.2 SA處理轉(zhuǎn)基因植株基因表達(dá)與SMV抗性分析62-63
• 3.3 轉(zhuǎn)基因植株的抗病毒效果63-64
• 第四章 結(jié)論與展望64-65
• 參考文獻(xiàn)65-74

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李宏業(yè),劉玉樂,梁承鄴,范樹國;雄性不育及育性恢復(fù)基因表達(dá)載體的構(gòu)建[J];熱帶作物學(xué)報(bào);1999年02期

2 武麗敏,江千濤,李琴,魏育明,鄭有良;LMW-GS16基因表達(dá)載體的構(gòu)建[J];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年04期

3 劉麗,賁昆龍;含有尿嘧啶DNA糖苷酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建[J];華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);1999年03期

4 鞏振輝,呂元紅,王曉敏;樟疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶16和17基因的克隆、測序及其真核表達(dá)研究[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2005年06期

5 王靜;嚴(yán)海燕;康強(qiáng)勝;;一種花生轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建[J];武漢植物學(xué)研究;2005年06期

6 劉芫;趙倩;敖光明;毛炎麟;;豇豆胰蛋白酶抑制劑基因的克隆及對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);1993年01期

7 邱旺;張東杰;;枯草芽孢桿菌apr基因表達(dá)載體的構(gòu)建[J];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào);2010年02期

8 鞏振輝,Arvid Gotesson,David A Jones;樟疫霉多聚半乳糖醛酸酶基因9和10的克隆、測序及其遺傳轉(zhuǎn)化研究[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2004年08期

9 薛印革,朱本忠,薛萍,田慧琴,羅云波;反義LeEIL2基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在番茄中的轉(zhuǎn)化[J];河南農(nóng)業(yè)科學(xué);2003年10期

10 朱永興;曹鵬;許興;孟青青;趙子丹;;多基因表達(dá)載體KCTB轉(zhuǎn)化寧夏枸杞的研究[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2010年09期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 蒲小勇;王行環(huán);王懷鵬;徐戰(zhàn)平;羅耀雄;胡禮泉;吳一龍;;人胰島素樣生長因子1基因表達(dá)載體的構(gòu)建[A];第5次全國中西醫(yī)結(jié)合男科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編暨男科提高班講義[C];2007年

2 王懷鵬;蒲小勇;王行環(huán);徐戰(zhàn)平;高煒城;楊中華;李世林;羅耀雄;陳浩陽;馮自衛(wèi);劉久敏;楊浣清;胡禮泉;;人胰島素樣生長因子1基因表達(dá)載體的構(gòu)建[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第八次全國男科學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

3 李慶章;姜毓君;;β-CPP二聚體基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其結(jié)構(gòu)分析[A];動(dòng)物生理生化學(xué)分會(huì)第八次學(xué)術(shù)會(huì)議暨全國反芻動(dòng)物營養(yǎng)生理生化第三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2004年

4 劉國通;楊成明;;pcDNA3．1-FKBP12．6基因表達(dá)載體的構(gòu)建及擴(kuò)增[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)第八次全國心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編[C];2006年

5 曾琪;胡巢鳳;;p53結(jié)合位點(diǎn)在NOD8基因調(diào)控中的作用[A];中國病理生理學(xué)會(huì)第九屆全國代表大會(huì)及學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2010年

6 任曉慧;張永亮;劉松財(cái);戴建威;郝林琳;章倩倩;侯峰;呂鐵鋼;周立光;吳瓊;盧可;齊建英;;基于RNA復(fù)制子的SS基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其在真核細(xì)胞中的表達(dá)[A];全國動(dòng)物生理生化第九次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2006年

7 查長森;王震;陳云波;呂建新;;肺炎克雷伯菌耐氨基糖苷類抗生素基因aac(3)-Ⅰ的改構(gòu)與功能研究[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2006年

8 韓冬梅;李秀錦;王幸興;王微;潘素敏;仲飛;;大腸桿菌不耐熱腸毒素A亞基基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的融合表達(dá)[A];全國動(dòng)物生理生化第十一次學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2010年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 唐婷　樸淑瑜;從基因的角度“看世界”[N];科技日報(bào);2007年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 杜秋麗;大豆泛素化系統(tǒng)E2和E3酶基因的克隆與功能研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

2 趙志東;牛ACSL1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

3 呂萍;小鼠Lrp5基因表達(dá)調(diào)控的研究[D];山東大學(xué);2005年

4 馬雪梅;神經(jīng)營養(yǎng)相關(guān)因子基因的克隆、表達(dá)及蛋白的純化研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1997年

5 孫全喜;超長鏈多不飽和脂肪酸合成相關(guān)酶基因的克隆與鑒定及其在作物中的異源合成[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

6 周偉光;果蠅嗅覺基因的篩選、鑒定及其功能的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

7 滕思勇;1. HERG通道孔區(qū)外口的錯(cuò)義突變對其功能的影響 2. hKCNE4新基因的克隆、表達(dá)及功能研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2002年

8 馬馨;轉(zhuǎn)賴氨酸基因小鼠和牛的研究[D];吉林大學(xué);2012年

9 梁宗敏;人源基因核糖體DNA區(qū)靶向載體VEGF165的構(gòu)建及其在細(xì)胞中的定點(diǎn)表達(dá)研究[D];中南大學(xué);2007年

10 呂波;植物開花基因FT的遺傳轉(zhuǎn)化及其參與開花調(diào)控的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊嬌;綿羊Rad51基因的克隆與真核表達(dá)[D];石河子大學(xué);2015年

2 趙俊亞;Fat-1轉(zhuǎn)基因克隆渤海黑牛研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

3 寧孟影;豬Zfx基因干擾載體篩選及性控效果的驗(yàn)證[D];石河子大學(xué);2015年

4 陳晨;家蠶miR-0001和miR-0015對BmFib-L基因表達(dá)的調(diào)控作用研究[D];江蘇科技大學(xué);2015年

5 關(guān)小燕;番茄促分裂原活化蛋白激酶基因SlMAPK7的表達(dá)特性與功能分析[D];浙江大學(xué);2014年

6 宋靜;中間偃麥草抗白粉病相關(guān)基因TiAsp的克隆與功能研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 羅蕊;EPSPS基因與Bar基因的克隆及在蓖麻中的功能驗(yàn)證[D];內(nèi)蒙古民族大學(xué);2015年

8 李麗新;喜樹sls-like基因在大腸桿菌中的表達(dá)與分析[D];黑龍江大學(xué);2012年

9 周超;水稻OsCBP20基因的克隆與功能分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 陳玉如;新生隱球菌格魯比變種毒力差異基因型菌株之間毒力相關(guān)基因的分析研究[D];貴陽醫(yī)學(xué)院;2014年

  本文關(guān)鍵詞：KR3和Hs1基因聚合對大豆花葉病毒病抗性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：316226