發(fā)布時間：2021-04-25 00:38

　　目的使用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除人類宮頸癌細胞HeLa中的細胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（cell division cycle 25 homolog C,Cdc25C）基因,構(gòu)建Cdc25C基因穩(wěn)定敲除細胞株。方法根據(jù)CRISPR/Cas9靶點設計規(guī)則,設計特異性識別Cdc25C基因第一外顯子相關序列的上下游小向?qū)NA（small guide RNA,sgRNA）,構(gòu)建真核重組表達質(zhì)粒。測序鑒定后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa細胞中,用嘌呤霉素（puromycin）抗性篩選穩(wěn)定敲除Cdc25C基因細胞株,再用免疫印跡方法鑒定細胞Cdc25C敲除效果。最后用流式細胞儀檢測基因敲除對細胞周期的影響。結(jié)果篩選出穩(wěn)定敲除Cdc25C基因細胞株,且Cdc25C敲除顯著影響G2/M期進程。結(jié)論利用CRISPR/Cas9技術成功獲得了內(nèi)源Cdc25C基因敲除細胞株,為研究Cdc25C在細胞周期進程的功能以及相關癌癥的發(fā)生奠定了基礎。 

【文章來源】：軍事醫(yī)學. 2017,41(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：4 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 細胞培養(yǎng)
        1.2.2 sgRNA的設計
        1.2.3 重組真核表達質(zhì)粒p Sp Cas9-Cdc25C的構(gòu)建
        1.2.4 Cdc25C基因敲除穩(wěn)定細胞株的篩選
        1.2.5 提取細胞基因組DNA并對目標片段進行測序
        1.2.6 穩(wěn)定細胞株的免疫印跡檢測
        1.2.7 細胞周期的檢測
2 結(jié)果
    2.1 重組表達載體p Sp Cas9-Cdc25C的構(gòu)建與鑒定
    2.2 免疫印跡篩選Cdc25C基因敲除細胞株克隆
    2.3 測序驗證Cdc25C的敲除效果
    2.4 Cdc25C基因敲除細胞株穩(wěn)定性的檢測
    2.5 Cdc25C基因敲除細胞株的周期進程檢測
3 討論



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