精準(zhǔn)基因組編輯使科學(xué)家可以按照意愿直接改變基因組序列,以研究基因功能,并有利于開發(fā)出安全、高度精確的基因治療方法。CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用Cas9核酸酶與單鏈導(dǎo)向RNA（sgRNA）復(fù)合物,通過更有效地誘導(dǎo)基因組中特定位點的DNA雙鏈斷裂,使研究人員能夠進行基因組編輯。DNA雙鏈斷裂主要由非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HDR）兩種機制來修復(fù)。相比NHEJ在DNA雙鏈斷裂處進行不可預(yù)測的堿基插入或者缺失,HDR可以利用與DNA雙鏈斷裂處周圍區(qū)域同源的外源性DNA為供體模板,以精確重組的方式修復(fù)DNA。精準(zhǔn)基因組編輯技術(shù)的核心是基于基因組雙鏈斷裂后的HDR修復(fù)機制。然而,在哺乳動物細(xì)胞基因組中,HDR修復(fù)效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于NHEJ修復(fù)效率,這限制了精準(zhǔn)編輯在哺乳動物細(xì)胞中的應(yīng)用。為了提高CRISPR/Cas9和HDR介導(dǎo)的精準(zhǔn)編輯效率,研究人員提出了抑制NHEJ通路、激活HDR通路或者控制細(xì)胞周期等方法,均在一定程度上提高了HDR效率。另外,由于較低的HDR效率,從所有處理過的細(xì)胞群中分離出基因精確修飾的陽性細(xì)胞尤其耗時、耗力。前期研究已經(jīng)開發(fā)的富集基因編輯細(xì)胞的方法主要基于篩選轉(zhuǎn)... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：114 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的工作機制

西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文基礎(chǔ)。負(fù)責(zé)編碼功能蛋白的 Cas 基因被稱為效應(yīng)復(fù)合物。CRISPR/Cas 系統(tǒng)分為兩類，每一類都有幾個類型與亞型（Makarova et al. 2015）。第一類 CRISPR/Cas 主要來自細(xì)菌和古生菌，包含 I、III 和 IV 型；第二類只在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，包含 II 和 V 型（Chylinski etal. 2014）。如圖 1-2 所示，第二類的功能蛋白的結(jié)構(gòu)相對第一類要更簡單一些。II 型和V 型中功能蛋白分別由 Cas9 和 Cpf1 單個大蛋白發(fā)揮作用。目前廣泛應(yīng)用的 Cas9 蛋白屬于 II 型。第一類的功能蛋白都為多亞基，由多個蛋白組成（Makarova et al. 2015）。Cas1和 Cas2 基因在除了 IV 型外的其它類型中都存在。不同的 Cas 蛋白在 CRISPR/Cas 系統(tǒng)中有不同的作用。Cas1蛋白是一種整合酶，它是通過切割Repeats區(qū)特異位點向CRISPR陣列插入新鑒定的間隔（spacer）所必需的。Cas2 蛋白的功能目前還不清楚，但是，該蛋白具有核糖核酸酶（RNase）和脫氧核糖核酸酶（DNase）活性，并用于大腸桿菌的適應(yīng)階段（Wiedenheft et al. 2009; Nunez et al. 2015）。

第一章 文獻(xiàn)綜述1.2 DNA 雙鏈斷裂的修復(fù)機制DNA 雙鏈斷裂（Double strands breaks，DSBs）嚴(yán)重威脅著基因組的完整性，細(xì)胞內(nèi)主要有兩種機制修復(fù) DSBs：非同源末端連接（Non-homologous end joining, NHEJ）和同源序列介導(dǎo)的同源重組（Homology-directed repair, HDR）（圖 1-3）（Decottignies2013）。基因編輯技術(shù)就是通過核酸酶技術(shù)切割基因組形成雙鏈斷裂，然后通過不同的修復(fù)機制來實現(xiàn)堿基插入、缺失或者替換。


本文編號：3134260