石杉?jí)A甲（Huperzine A,Hup A）是一種高效中樞乙酰膽堿酯酶抑制劑,可應(yīng)用于輕中度阿爾茨海默病的治療。石杉科植物如千層塔是石杉?jí)A甲的主要天然來(lái)源,但是由于資源短缺,組織培養(yǎng)難度過(guò)大,人工合成步驟繁瑣及高成本限制了石杉?jí)A甲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。植物內(nèi)生真菌因其生長(zhǎng)周期短、易于培養(yǎng)且低成本等優(yōu)點(diǎn),漸漸成為了研究植物次生代謝產(chǎn)物合成的熱點(diǎn),為HupA生物合成研究提供了新思路。隨著近年來(lái)表觀遺傳學(xué)研究的發(fā)展,表觀調(diào)控在真菌研究領(lǐng)域顯示出巨大潛力。表觀遺傳學(xué)指染色體DNA序列不發(fā)生改變的情況下,基因表達(dá)發(fā)生了可遺傳的變化,從分子機(jī)制角度來(lái)看表觀遺傳調(diào)控是由環(huán)境因素引起的生物細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)發(fā)生了化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾,主要包括DNA甲基化,組蛋白修飾,RNA干擾等幾個(gè)方面,這些調(diào)節(jié)模式極易受到環(huán)境的影響。HupA作為膠包炭疽次生代謝產(chǎn)物,其產(chǎn)量的積累受環(huán)境因素所調(diào)控,因此研究表觀遺傳對(duì)膠包炭疽合成HupA影響并闡釋產(chǎn)量積累的分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。目前對(duì)真菌的表觀研究手段主要是通過(guò)基因工程敲除或過(guò)表達(dá)相關(guān)表觀修飾基因,或者利用小分子表觀遺傳試劑兩個(gè)方面。本課題組在前期工作中從千層塔中分離出具有產(chǎn)Hup... 

【文章來(lái)源】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省

【文章頁(yè)數(shù)】：74 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

石杉?jí)A甲的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文6圖1-2石杉?jí)A甲生物合成推測(cè)途徑Fig.1-2ProposedbiosyntheticpathwayofHupA1.2.4植物內(nèi)生真菌植物內(nèi)生真菌(Endophyticfungi)指部分或整個(gè)部生活史存活于健康植物組織體內(nèi)，且對(duì)宿主植物無(wú)（或暫時(shí)）致病性的一類(lèi)真菌[52]。主要分布于植物根、莖、葉、等器官、組織，極具豐富的生物多樣性。它們是與植物組織處于互惠共利或互不影響狀態(tài)的共生真菌，也包括潛伏的病原微生物[53]。內(nèi)生真菌的研究始于19世紀(jì)末，至今已有100多年的歷史，研究范圍也僅限于小麥等重要的經(jīng)濟(jì)植物中[9]。直到1993Stierle從藥用植物太平洋短葉紅豆杉韌皮部中分離到1株能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae以來(lái)[54]，人們認(rèn)識(shí)到藥用植物中內(nèi)生真菌具備產(chǎn)生與宿主植物相同或類(lèi)似藥用活性成分的潛力，為解決珍稀瀕危藥用植物資源保護(hù)和可持續(xù)利用提供了新的研究思路。這可能是內(nèi)生真菌與寄主植物通過(guò)長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化得來(lái)的，內(nèi)生真菌與藥用植物共生過(guò)程牽涉細(xì)胞形態(tài)形成、

第1章前言9飾，如構(gòu)巢曲霉中敲除編碼H3K4基因CclA后H3K4甲基化水平顯著降低，并伴隨著H3K9的甲基化水平下降，結(jié)果激活了至少2條沉默基因簇的表達(dá)以及8種新化合物的產(chǎn)生，可大大提高遺傳穩(wěn)定性[16]。開(kāi)展內(nèi)生真菌中石杉?jí)A甲的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制研究，對(duì)利用合成生物學(xué)技術(shù)改造和優(yōu)化天然表達(dá)體系，或者在異源宿主中重建生物合成途徑，構(gòu)建石杉?jí)A甲高產(chǎn)菌株具有重大意義。圖1-3染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位—核小體Fig.1-3TheBasicStructuralUnitofChromatin—Nucleosome1.3研究?jī)?nèi)容和技術(shù)路線(xiàn)(1)本研究以從千層塔中分離出具有產(chǎn)HupA能力的內(nèi)生真菌膠胞炭疽為研究對(duì)象，通過(guò)在內(nèi)生真菌發(fā)酵過(guò)程中添加兩種小分子表觀遺傳抑制劑，分別是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑—5-雜氮胞苷（5-Azacytidine，5-AC）；組蛋白去乙�；敢种苿焖徕c（SodiumValproate，SV）、煙酰胺（Nicotinamide，NIC）、丁酸鈉（Sodiumbutyrate，SB）、曲古柳菌素（TrichostatinA，TSA）探究對(duì)Cg01生物量及合成HupA的影響。驗(yàn)證表觀遺傳修飾具有調(diào)控內(nèi)生真菌膠胞炭疽合成HupA作用，為結(jié)合前期工作篩選候選基因提供基矗(2)采取PEG介導(dǎo)的同源重組轉(zhuǎn)化法，對(duì)篩選獲得的4個(gè)表觀遺傳相關(guān)候選基因（Cg-HAT-09571、Cg-HMT-13874、Cg-HDAC-15620、Cg-HAT-02312）進(jìn)行敲除與回補(bǔ)，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)了回補(bǔ)株中對(duì)應(yīng)基因表達(dá)量以及高效液相色譜HPLC檢測(cè)突變體菌株中石杉?jí)A甲產(chǎn)量。(3)通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀聯(lián)合高通量測(cè)序（Chip-seq）試驗(yàn)獲得Cg-HMT-13874基因敲除突變體關(guān)聯(lián)基因。(4)通過(guò)RNA-seq探究關(guān)聯(lián)基因轉(zhuǎn)錄水平并聯(lián)合Chip-seq分析得到影響Cg01合成HupA的關(guān)鍵基因。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]藥用植物內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)[J]. 郭順星.  菌物學(xué)報(bào). 2018(01)
[2]中藥有效成分石杉?jí)A甲治療阿爾茨海默病的研究進(jìn)展[J]. 李琳,杜巖.  實(shí)用老年醫(yī)學(xué). 2017(07)
[3]絲狀真菌在纖維素酶合成過(guò)程中碳源代謝調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 董妙音,王曙陽(yáng),王雨辰,許富強(qiáng),李文建,陳積紅,劉敬,胡偉.  中國(guó)釀造. 2016(10)
[4]抗阿爾茨海默病藥物臨床研究進(jìn)展[J]. 彭英,李萍萍,李琳,張喻,侯偉貞,崔丹丹,李江,王玲,王慶利,王曉良.  藥學(xué)學(xué)報(bào). 2016(08)
[5]血漿多巴胺β羥化酶與阿爾茨海默病相關(guān)性研究[J]. 孟云,朱言亮.  中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué). 2015(09)
[6]化學(xué)表觀遺傳修飾方法在真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物研究中的應(yīng)用[J]. 張偉,陳敏,邵長(zhǎng)倫,王長(zhǎng)云.  中國(guó)海洋藥物. 2014(05)
[7]石杉?jí)A甲的合成研究進(jìn)展[J]. 鄭書(shū)巖,郁春輝,沈征武.  有機(jī)化學(xué). 2013(11)
[8]藥用植物金銀花的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)探討[J]. 方利娟.  寧夏農(nóng)林科技. 2013(05)
[9]藥用裸子植物內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀與展望[J]. 解修超,陳文強(qiáng),鄧百萬(wàn),彭浩,張曉偉,張曼.  江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2013(02)
[10]高效液相色譜法定量測(cè)定中藥千層塔提取物中的石杉?jí)A甲[J]. 張敬彩,魏杰,鐘虹敏,郭志謀,張華.  色譜. 2013(01)

博士論文
[1]遺傳、基因和進(jìn)化[D]. 陸俏穎.中山大學(xué) 2016
[2]從肺論治AD的理論探討及補(bǔ)肺宣肺通腑降濁方治療AD的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 魏錄翠.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 2009

碩士論文
[1]組蛋白修飾對(duì)里氏木霉纖維素酶表達(dá)的初步研究[D]. 周嬌嬌.深圳大學(xué) 2017
[2]cre4基因在里氏木霉中對(duì)纖維素酶表達(dá)的調(diào)控研究[D]. 劉雯莉.深圳大學(xué) 2016
[3]化學(xué)表觀遺傳修飾法研究�？麃�(lái)源月?tīng)钚咔痪x產(chǎn)物多樣性初探[D]. 張偉.中國(guó)海洋大學(xué) 2014
[4]內(nèi)側(cè)隔核注射淀粉樣β蛋白對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制研究[D]. 孔林林.山西醫(yī)科大學(xué) 2013
[5]曼地亞紅豆杉中產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分離鑒定[D]. 郭俊柯.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2012
[6]千層塔組織培養(yǎng)體系的建立及激素對(duì)叢生苗生長(zhǎng)和石杉?jí)A甲合成的影響[D]. 梁昊.合肥工業(yè)大學(xué) 2010
[7]琥珀八氫氨吖啶對(duì)膽堿酯酶的抑制研究[D]. 楊會(huì).吉林大學(xué) 2007



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