石杉堿甲（Huperzine A,Hup A）是一種高效中樞乙酰膽堿酯酶抑制劑,可應用于輕中度阿爾茨海默病的治療。石杉科植物如千層塔是石杉堿甲的主要天然來源,但是由于資源短缺,組織培養(yǎng)難度過大,人工合成步驟繁瑣及高成本限制了石杉堿甲產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。植物內(nèi)生真菌因其生長周期短、易于培養(yǎng)且低成本等優(yōu)點,漸漸成為了研究植物次生代謝產(chǎn)物合成的熱點,為HupA生物合成研究提供了新思路。隨著近年來表觀遺傳學研究的發(fā)展,表觀調(diào)控在真菌研究領域顯示出巨大潛力。表觀遺傳學指染色體DNA序列不發(fā)生改變的情況下,基因表達發(fā)生了可遺傳的變化,從分子機制角度來看表觀遺傳調(diào)控是由環(huán)境因素引起的生物細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)發(fā)生了化學結(jié)構(gòu)修飾,主要包括DNA甲基化,組蛋白修飾,RNA干擾等幾個方面,這些調(diào)節(jié)模式極易受到環(huán)境的影響。HupA作為膠包炭疽次生代謝產(chǎn)物,其產(chǎn)量的積累受環(huán)境因素所調(diào)控,因此研究表觀遺傳對膠包炭疽合成HupA影響并闡釋產(chǎn)量積累的分子機制具有重要的科學意義。目前對真菌的表觀研究手段主要是通過基因工程敲除或過表達相關表觀修飾基因,或者利用小分子表觀遺傳試劑兩個方面。本課題組在前期工作中從千層塔中分離出具有產(chǎn)Hup... 

【文章來源】：湖南農(nóng)業(yè)大學湖南省

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

石杉堿甲的化學結(jié)構(gòu)式

湖南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文6圖1-2石杉堿甲生物合成推測途徑Fig.1-2ProposedbiosyntheticpathwayofHupA1.2.4植物內(nèi)生真菌植物內(nèi)生真菌(Endophyticfungi)指部分或整個部生活史存活于健康植物組織體內(nèi)，且對宿主植物無（或暫時）致病性的一類真菌[52]。主要分布于植物根、莖、葉、等器官、組織，極具豐富的生物多樣性。它們是與植物組織處于互惠共利或互不影響狀態(tài)的共生真菌，也包括潛伏的病原微生物[53]。內(nèi)生真菌的研究始于19世紀末，至今已有100多年的歷史，研究范圍也僅限于小麥等重要的經(jīng)濟植物中[9]。直到1993Stierle從藥用植物太平洋短葉紅豆杉韌皮部中分離到1株能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae以來[54]，人們認識到藥用植物中內(nèi)生真菌具備產(chǎn)生與宿主植物相同或類似藥用活性成分的潛力，為解決珍稀瀕危藥用植物資源保護和可持續(xù)利用提供了新的研究思路。這可能是內(nèi)生真菌與寄主植物通過長期的協(xié)同進化得來的，內(nèi)生真菌與藥用植物共生過程牽涉細胞形態(tài)形成、

第1章前言9飾，如構(gòu)巢曲霉中敲除編碼H3K4基因CclA后H3K4甲基化水平顯著降低，并伴隨著H3K9的甲基化水平下降，結(jié)果激活了至少2條沉默基因簇的表達以及8種新化合物的產(chǎn)生，可大大提高遺傳穩(wěn)定性[16]。開展內(nèi)生真菌中石杉堿甲的表觀遺傳調(diào)控機制研究，對利用合成生物學技術改造和優(yōu)化天然表達體系，或者在異源宿主中重建生物合成途徑，構(gòu)建石杉堿甲高產(chǎn)菌株具有重大意義。圖1-3染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位—核小體Fig.1-3TheBasicStructuralUnitofChromatin—Nucleosome1.3研究內(nèi)容和技術路線(1)本研究以從千層塔中分離出具有產(chǎn)HupA能力的內(nèi)生真菌膠胞炭疽為研究對象，通過在內(nèi)生真菌發(fā)酵過程中添加兩種小分子表觀遺傳抑制劑，分別是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑—5-雜氮胞苷（5-Azacytidine，5-AC）；組蛋白去乙�；敢种苿焖徕c（SodiumValproate，SV）、煙酰胺（Nicotinamide，NIC）、丁酸鈉（Sodiumbutyrate，SB）、曲古柳菌素（TrichostatinA，TSA）探究對Cg01生物量及合成HupA的影響。驗證表觀遺傳修飾具有調(diào)控內(nèi)生真菌膠胞炭疽合成HupA作用，為結(jié)合前期工作篩選候選基因提供基矗(2)采取PEG介導的同源重組轉(zhuǎn)化法，對篩選獲得的4個表觀遺傳相關候選基因（Cg-HAT-09571、Cg-HMT-13874、Cg-HDAC-15620、Cg-HAT-02312）進行敲除與回補，并通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測了回補株中對應基因表達量以及高效液相色譜HPLC檢測突變體菌株中石杉堿甲產(chǎn)量。(3)通過染色質(zhì)免疫共沉淀聯(lián)合高通量測序（Chip-seq）試驗獲得Cg-HMT-13874基因敲除突變體關聯(lián)基因。(4)通過RNA-seq探究關聯(lián)基因轉(zhuǎn)錄水平并聯(lián)合Chip-seq分析得到影響Cg01合成HupA的關鍵基因。

【參考文獻】：
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