成熟水稻種子胚乳中的淀粉含量約占種子干重的80%,因而稻米食味品質(zhì)受淀粉品質(zhì)直接影響。淀粉由支鏈淀粉和直鏈淀粉組成,淀粉合成過程受一些列酶調(diào)控。淀粉合成的底物是ADPG,由ADP-Glc焦磷酸化酶（AGPase）催化合成,起催化作用的部位位于該酶的小亞基AGPS。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻淀粉合成相關(guān)基因AGPS1進行編輯,得到以下結(jié)論:1、本研究中以粳稻品種“嘉花1號”（JH）為研究對象,利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功對AGPase的一個小亞基基因AGPS1（LOC_Os08g25734）進行了編輯,獲得了插入一個堿基C的編輯植株,也證明了利用CRISPR/Cas9技術(shù)改變水稻淀粉品質(zhì)的可行性。2、T₁代共有4株苗存活,將其命名為k1、k2、k3、k4,單獨收取其種子,并進行自交繁殖后代。k1后代始終保留了轉(zhuǎn)基因載體,k2、k3、k4獲得了剔除轉(zhuǎn)基因載體的突變體。3、分別對突變體k1和k4的種子中與淀粉合成相關(guān)的11個基因進行轉(zhuǎn)錄水平的表達量分析。突變體k1在發(fā)育后期GBSSⅡ、SBE1、SBE3基因的表達量明顯高于野生型... 

【文章來源】：上海師范大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

單靶點U6a-T-gRNA表達盒構(gòu)建和擴增模式圖

上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文材料與方法13③回收純化U6a-T-gRNA表達盒對U6a-T-gRNA表達盒的克隆產(chǎn)物進行電泳分析，對約600bp位置的電泳條帶進行切膠回收純化（本實驗?zāi)z回收均使用康為世紀公司的膠回收試劑盒），然后以B1/BL為引物進行擴增并送公司測序驗證，驗證正確的U6a-T-gRNA表達盒放置于-20℃保存?zhèn)溆�。④連接MH終載同樣采用邊切邊連的方法將gRNA表達盒連入MH最終載體。以上一步驗證正確的U6a-T-gRNA表達盒純化產(chǎn)物作為原料，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：U6a-T-gRNA表達盒連接MH終載模式圖如下：圖2-3單靶點U6a-T-gRNA表達盒連接MH終載模式圖（3）雙靶點質(zhì)粒載體構(gòu)建構(gòu)建雙靶點載體的過程也分為構(gòu)建、擴增、回收純化gRNA表達盒以及連接MH終載。構(gòu)建雙靶點gRNA表達盒時，分別將第一個和第二個靶點接頭引物與U6a質(zhì)粒和U6b質(zhì)粒連接構(gòu)成U6a-T-gRNA表達盒和U6b-T-gRNA表達盒。反應(yīng)體MH質(zhì)粒2μlU6a-T-gRNA4μlBsaⅠ1μlBsaⅠbuffer1μlT4連接酶1μlT4buffer3μlddH2O3μl總體積15μl37℃，2min10℃，3min20℃，5min37℃，2min16℃保存反應(yīng)條件15個循環(huán)

上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文材料與方法15構(gòu)建并擴增U6a-T-gRNA與U6b-T-gRNA表達盒的模式圖如下：圖2-4雙靶點U6a-T-gRNA與U6b-T-gRNA表達盒構(gòu)建和擴增模式圖對第二輪克隆產(chǎn)物進行電泳，帶長為600bp左右的是U6a-T-gRNA表達盒，U6b-T-gRNA表達盒電泳帶長為500bp左右，分別切膠回收純化。然后分別以引物B1/B2擴增U6a-T-gRNA表達盒純化產(chǎn)物，以引物B2’/BL擴增U6b-T-gRNA表達盒純化產(chǎn)物，并測序驗證。構(gòu)建雙靶點MH終載時，將測序驗證后的U6a-T-gRNA和U6b-T-gRNA表達盒混合在一起通過邊切邊連的方法連接到MH終載質(zhì)粒上。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：U6a-T-gRNA和U6b-T-gRNA表達盒連接MH終載模式圖如下：MH質(zhì)粒4μlU6a-T-gRNA3μlU6b-T-gRNA3μlBsaⅠ0.5μlBsaⅠbuffer1.5μlT4連接酶0.5μlT4buffer2.5μl總體積15μl37℃，2min10℃，3min20℃，5min37℃，2min16℃保存反應(yīng)條件15個循環(huán)

【參考文獻】：
期刊論文
[1]應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯水稻SBE3基因獲得高抗性淀粉水稻新品系[J]. 白建江,張建明,樸鐘澤,方軍,李剛燮,王亞,楊瑞芳.  分子植物育種. 2018(05)
[2]轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良水稻淀粉品質(zhì)研究進展[J]. 丁一,丁箐雯,李冰清,沈易,張寧,吳殿星.  中國稻米. 2018(01)
[3]CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯水稻W(wǎng)x基因[J]. 汪秉琨,張慧,洪汝科,張錦文,楊睿,羅瓊,曾千春.  中國水稻科學(xué). 2018(01)
[4]CRISPR/Cas9系統(tǒng):基因組定點編輯技術(shù)及其在植物基因功能研究中的應(yīng)用[J]. 包愛科,白天惠,趙天璇,蘇家豪.  草業(yè)學(xué)報. 2017(07)
[5]水稻胚乳淀粉合成相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)、功能及其互作研究進展[J]. 陳雅玲,包勁松.  中國水稻科學(xué). 2017(01)
[6]水稻種子淀粉合成及其調(diào)控研究進展[J]. 彭波,龐瑞華,孫艷芳,李慧龍,宋曉華,周棋贏,宋世枝,李梁浩,江毅丹,袁紅雨.  江西農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2016(06)
[7]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻基因編輯中的應(yīng)用研究進展[J]. 陳偉潘.  南方農(nóng)業(yè). 2015(03)
[8]高溫對水稻胚乳淀粉合成關(guān)鍵酶活性及內(nèi)源激素含量的影響[J]. 張桂蓮,廖斌,武小金,肖應(yīng)輝,肖浪濤,陳立云.  植物生理學(xué)報. 2014(12)
[9]胚乳中淀粉的合成[J]. 劉德瑞,蔡秀玲.  植物生理學(xué)報. 2011(11)
[10]直鏈淀粉和支鏈淀粉的表征[J]. 李海普,李彬,歐陽明,張莎莎.  食品科學(xué). 2010(11)

博士論文
[1]水稻糊化溫度特性的理化基礎(chǔ)與分子遺傳學(xué)研究[D]. 舒小麗.浙江大學(xué) 2006

碩士論文
[1]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯水稻淀粉合成相關(guān)的SSIIIα與PPDK的定點突變研究[D]. 吳清清.上海師范大學(xué) 2019
[2]普通水稻淀粉結(jié)構(gòu)和功能特性研究[D]. 蔡金文.揚州大學(xué) 2015
[3]轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良稻米直鏈淀粉含量的研究[D]. 于恒秀.揚州大學(xué) 2002



本文編號：3118553