背景:由于腫瘤異質性,常導致腫瘤靶向治療（如EGFR）和抗PD-1治療的反應差異性和失敗。傳統(tǒng)的原發(fā)灶單點組織活檢,僅代表部分腫瘤細胞克隆或亞克隆,缺乏轉移灶信息。循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）理論上來自體內多部位腫瘤,具有更好的代表性,含蓋信息更為全面,腫瘤突變異質性可表現在CTCs基因組中,深入單個CTCs水平研究,有助于最終闡明腫瘤異質性現象和解析腫瘤進程中基因組發(fā)生的動態(tài)和持續(xù)性突變演化全貌。研究方法:1. 單個CTCs分離技術及肺癌患者檢測�；贑ell Search原理,優(yōu)化Ep CAM抗體,改進細胞破膜環(huán)節(jié),肺癌患者抗凝外周血5ml,用Ep CAM免疫磁珠富集CTCs,經Ep CAM熒光信號放大、CD45、PD-L1和Hoechst免疫熒光染色鑒定CTCs,銜接顯微操作分離單個CTCs,進行單細胞水平基因組DNA提取和擴增,采用肺癌72個靶基因定向測序,分析各基因突變拷貝數變異（CNV）和基因突變位點,進一步確證CTCs。共入組98例肺癌患者,分析臨床檢測CTCs效能。2. 肺癌組織與單個CTCs基因突變異質性分析。（1）EGFR基因突變異質性分析組織存在EGFR靶向治療敏感突... 

【文章來源】：北京市結核病胸部腫瘤研究所北京市

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抗人CD326抗體對人肺癌細胞系NCI-H2009免疫熒光染色

北京市結核病胸部腫瘤研究所博士學位論文26圖1抗人CD326抗體對人肺癌細胞系NCI-H2009免疫熒光染色。不加CD326免疫磁珠組直接用熒光抗體染色。加CD326磁珠組，用CD326磁珠4℃孵育30min，離心洗滌2次后再用熒光抗體染色（10×10倍）。圖2anti-MousepAb與外周血白細胞結合試驗。人外周血用紅細胞裂解液去除紅細胞，加CD326免疫磁珠4℃孵育30min，洗滌2次后，再用anti-MousepAb-dylight488染色（10×10倍）。2.摻入試驗優(yōu)化的CTCs染色方案經過優(yōu)化后，確定EpCAM(GoatAnti-MousepAbdylight488）、CD45(Anti-CD45antibody[MEM-28]APC)、核染料Hoechst33342方案進行染色。肺癌細胞NCI-H2009摻入健康人外周血中，經過紅細胞裂解、CD326磁珠富集

北京市結核病胸部腫瘤研究所博士學位論文27肺癌細胞，用熒光抗體進行染色，染色結果如圖3所示。EpCAM染色明亮，境界清晰，所摻入的肺癌細胞均能顯色，且未發(fā)現白細胞的非特異性結合。圖3為EpCAM(CD326)染色結果，顯示利用小鼠抗人CD326磁珠作為一抗，GoatAnti-MousepAb（dylight488）作為二抗染色，避免了抗CD326熒光抗體與抗CD326磁珠表位競爭。圖3優(yōu)化染色方案染色外周血摻入的肺癌系NCI-H2009。經CD326免疫磁珠富集后，用免疫熒光抗體(GoatAnti-MousepAbdylight488）、CD45(Anti-CD45antibody[MEM-28]APC)、核染料Hoechst33342染色（20×10倍）。3.肺癌患者CTCs的鑒定肺癌患者的外周血，經紅細胞裂解及CD326免疫磁珠富集CTCs后，隨后采用上述優(yōu)化后的染色方案檢測CTCs。以EpCAM(GoatAnti-MousepAbdylight488）、CD45(Anti-CD45antibody[MEM-28]APC)、核染料Hoechst33342進行染色，CTCs判定標準即為EpCAM+/Hoechst+/CD45-；白細胞（WBC）判定標準為EpCAM-/Hoechst+/CD45+。圖4所示為肺癌患者CTCs熒光顯微鏡下成像圖。我們銜接MMI-CellEctorPlus單細胞挑選平臺，將染色鑒定的肺癌患者CTCs分

【參考文獻】：
期刊論文
[1]單細胞測序技術及其在腫瘤研究和臨床診斷中的應用[J]. 周瑩,黃華藝.  分子診斷與治療雜志. 2017(03)



本文編號：3114818