目的建立以多重PCR捕獲為基礎(chǔ)的ABO血型基因二代測序（next-generation sequencing,NGS）分型技術(shù),結(jié)合血清學(xué)鑒定技術(shù),對(duì)ABO血型準(zhǔn)確定型。方法開發(fā)用于ABO血型的多重PCR捕獲的NGS技術(shù),靶向捕獲ABO基因全序列建立DNA文庫,利用Illumina NGS平臺(tái)對(duì)20例深圳市血液中心健康無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本做ABO基因測序分型;同時(shí)用血型血清學(xué)方法、PCR-SSP基因分型方法、以及第6、7外顯子Sanger測序?qū)ν慌鷺?biāo)本做ABO血型鑒定,以驗(yàn)證這種NGS技術(shù)做ABO血型鑒定的準(zhǔn)確性。結(jié)果 1)利用新建立的靶向捕獲二代測序技術(shù)對(duì)20例健康無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本ABO基因的測序分析:平均測序深度為4 667±893,特異性與均一性分別為92.59%和92.47%,測序深度>20覆蓋度為98.25%,均得到了唯一的分型結(jié)果。2)新建立的靶向捕獲二代測序技術(shù)對(duì)于20例標(biāo)本做的ABO全基因測序分型所得結(jié)果與血清學(xué)鑒定方法和基因分型技術(shù)的結(jié)果相符。結(jié)論成功建立了ABO基因多重PCR靶向捕獲NGS測序技術(shù),可以滿足ABO血型的鑒定要求。 

【文章來源】：中國輸血雜志. 2020,33(09)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

引物設(shè)計(jì)流程圖

設(shè)計(jì)并合成靶向富集ABO基因所需的多重PCR引物共124對(duì), 擴(kuò)增子產(chǎn)物長度97—275 bp,覆蓋ABO基因全長90.92%區(qū)域、91.82%堿基(22 575/24 830),包括ABO基因全部7個(gè)外顯子和內(nèi)含子區(qū)域。利用設(shè)計(jì)好的引物Panel,擴(kuò)增ABO基因目的區(qū)域片段,建立DNA文庫并做凝膠電泳質(zhì)檢:目標(biāo)條帶清晰(400 bp附近),說明DNA文庫構(gòu)建成功;同時(shí)擴(kuò)增條帶在150 bp附近雖然存在一定的二聚體,但是后期能夠通過數(shù)據(jù)過濾將此測序數(shù)據(jù)去除,不會(huì)影響最終的分型結(jié)果(圖2)。質(zhì)檢合格定量后在illumina平臺(tái)上機(jī)測序,得到測序數(shù)據(jù)。2.2 靶向捕獲的NGS測序分型結(jié)果及評(píng)價(jià)

表2 20例無償獻(xiàn)血者標(biāo)本的ABO基因捕獲NGS結(jié)果分析 Total Read ReadMappedGenome ReadMap Target Uniformity(%) Specificity(%) MeanDepth Depth>=20(%) Depth>=100(%) 1號(hào)標(biāo)本 839 394 551 259 515 775 91.13 93.5 4 159 97.58 95.97 2號(hào)標(biāo)本 756 056 514 972 480 445 90.32 93.24 3 874 98.39 95.97 3號(hào)標(biāo)本 821 341 602 786 563 562 87.9 93.44 4 544 96.77 95.16 4號(hào)標(biāo)本 714 116 479 549 446 526 88.71 93.06 3 601 97.58 94.35 5號(hào)標(biāo)本 688 415 377 536 335 823 88.71 88.85 2 708 95.16 92.74 6號(hào)標(biāo)本 1 000 000 808 417 769 570 95.16 95.16 6 206 97.58 97.58 7號(hào)標(biāo)本 884 720 614 691 573 067 95.16 93.18 4 621 97.58 97.58 8號(hào)標(biāo)本 909 274 624 574 559 294 95.16 89.48 4 510 97.58 97.58 9號(hào)標(biāo)本 831 949 564 778 517 086 95.16 91.5 4 170 97.58 97.58 10號(hào)標(biāo)本 887 624 628 350 600 372 95.16 95.5 4 841 97.58 97.58 11號(hào)標(biāo)本 783 121 507 415 458 086 93.55 90.21 3 694 97.58 97.58 12號(hào)標(biāo)本 805 657 514 039 479 946 86.29 93.32 3 870 95.16 91.94 13號(hào)標(biāo)本 951 887 774 488 742 173 93.55 95.79 5 985 97.58 97.58 14號(hào)標(biāo)本 847 078 647 624 612 509 94.35 94.54 4 939 97.58 97.58 15號(hào)標(biāo)本 701 258 462 041 423 104 94.35 91.53 3 412 97.58 97.58 16號(hào)標(biāo)本 691 806 456 740 424 314 92.74 92.84 3 421 97.58 97.58 17號(hào)標(biāo)本 750 176 530 674 499 262 94.35 94.04 4 026 97.58 97.58 18號(hào)標(biāo)本 778 248 575 402 543 338 94.35 94.38 4 381 97.58 97.58 19號(hào)標(biāo)本 909 671 706 092 688 559 94.35 97.48 5 552 97.58 97.58 20號(hào)標(biāo)本 787 988 600 414 569 992 92.74 94.89 4 596 98.39 97.58 平均 859 121 622 038 578 846 92.595 4 92.476 6 4 667.62 98.256 8 97.292.3 ABO血型血清學(xué)鑒定、PCR-SSP與第6、7外顯子Sanger測序?qū)Π邢虿东@的NGS測序技術(shù)的驗(yàn)證

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]基因分型預(yù)測ABO亞型的局限性[J]. 趙桐茂.  臨床輸血與檢驗(yàn). 2018(02)



本文編號(hào)：3109435