β-胡蘿卜素是天然的著色劑和營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)劑,在食品行業(yè)受到廣泛應(yīng)用。目前,通過(guò)代謝工程菌株有望提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量,從而替代天然提取或化學(xué)合成方法。由于β-胡蘿卜素的生物合成涉及多個(gè)基因,構(gòu)建高效合成代謝途徑成為獲得高產(chǎn)β-胡蘿卜素工程菌株的關(guān)鍵。本論文利用合成生物學(xué)和代謝工程手段構(gòu)建產(chǎn)β-胡蘿卜素大腸桿菌工程菌株,并聯(lián)合理性改造、隨機(jī)誘變和發(fā)酵優(yōu)化技術(shù)建立了提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量的可行策略。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.β-胡蘿卜素合成代謝途徑組裝及工程菌株構(gòu)建。首先,分析運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）ZM4菌株的啟動(dòng)子元件活性,篩選出代表性的啟動(dòng)子和終止子元件分別構(gòu)建元件庫(kù)。其次,利用Golden Gate技術(shù)將來(lái)自成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）CGMCC 1.2244的β-胡蘿卜素合成基因簇與元件庫(kù)進(jìn)行隨機(jī)組裝并獲得43株工程菌,其中Crt1-29的β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高為0.68 mg/g細(xì)胞干重（DCW）。2.理性設(shè)計(jì)優(yōu)化β-胡蘿卜素合成代謝。為進(jìn)一步優(yōu)化β-胡蘿卜素生物合成途徑,將β-胡蘿卜素合成基因簇分為crtE、crtXYI和crtB三... 

【文章來(lái)源】：成都大學(xué)四川省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

β-胡蘿卜素生物合成途徑

成都大學(xué)碩士學(xué)位論文9圖1.2BsmBⅠ、BbsⅠ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)Fig.1.2TherecognitionsiteofrestrictionendonucleasesBsmBⅠandBbsⅠ同樣基于核酸外切酶發(fā)展的Gibson組裝技術(shù)[88]也可在體外實(shí)現(xiàn)多個(gè)末端具有重疊序列的DNA片段組裝，反應(yīng)時(shí)間只需15-60min，但是組裝效率和準(zhǔn)確率會(huì)隨著組裝片段增加而降低。SLIC技術(shù)則是利用T4DNA聚合酶發(fā)揮的外切活性將DNA消化產(chǎn)生重疊序列，經(jīng)過(guò)退火實(shí)現(xiàn)組裝，是構(gòu)建生物合成途徑的有效方法，但該技術(shù)組裝的片段不能過(guò)大。DNA元件組裝技術(shù)是合成生物學(xué)的重要工具，除文中提到的技術(shù)外，其他許多DNA組裝技術(shù)也快速的發(fā)展起來(lái)，為高效和快速地實(shí)現(xiàn)大片段組裝以及多元件庫(kù)優(yōu)化等提供了可能。表1.2不同DNA組裝技術(shù)特點(diǎn)Tab.1.2ThecharacteristicsofdifferentDNAassemblytechnologies技術(shù)名稱優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)OE-PCR高效、無(wú)痕對(duì)DNA聚合酶高保真度有依賴性，組裝片段不能過(guò)大BioBrick可進(jìn)行多片段組裝存在DNA殘痕，對(duì)DNA序列有依賴性GoldenGate高效、無(wú)痕，可一次實(shí)現(xiàn)多個(gè)片段的組裝對(duì)DNA序列有依賴性GibsonAssembly無(wú)痕且可進(jìn)行大片段組裝效率和正確率會(huì)隨著組裝片段增加而降低，存在重復(fù)片段時(shí)難以組裝SLIC高效、無(wú)痕片段不能過(guò)大TAR高效能實(shí)現(xiàn)整個(gè)基因組的組裝片段過(guò)大或存在重復(fù)序列時(shí)會(huì)發(fā)生片段斷裂缺失1.4誘變育種微生物在食品、醫(yī)藥和環(huán)境等領(lǐng)域一直發(fā)揮著重要作用，而野生菌株因其不良特性（如產(chǎn)量低、耐受性差、副產(chǎn)物等）的影響往往無(wú)法滿足市場(chǎng)的需求。為獲得高產(chǎn)、性能優(yōu)良的菌株，對(duì)微生物進(jìn)行誘變處理成為改善微生物的有力工具。誘變育種具有操作簡(jiǎn)便和突變譜廣的特點(diǎn)，并且不需要了解菌株的遺傳背景，適用于多種工業(yè)微生物的育

成都大學(xué)碩士學(xué)位論文111.5論文設(shè)計(jì)1.5.1研究目的與意義本研究旨在結(jié)合合成生物學(xué)、代謝工程技術(shù)、誘變篩選和發(fā)酵工程技術(shù)，通過(guò)理性設(shè)計(jì)結(jié)合隨機(jī)誘變和發(fā)酵優(yōu)化，建立一套高效的多基因代謝途徑組裝、篩選和優(yōu)化技術(shù)方法，實(shí)現(xiàn)生物基化學(xué)品產(chǎn)量的提升。本研究也為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌內(nèi)源性生物元件的評(píng)估和應(yīng)用、建立多基因代謝途徑的高效組裝，以及代謝工程體系優(yōu)化過(guò)程提供了參考。1.5.2研究?jī)?nèi)容本文通過(guò)GoldenGate先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行了β-胡蘿卜素合成途徑的組裝和優(yōu)化，獲得產(chǎn)β-胡蘿卜素大腸桿菌工程菌株，并通過(guò)常壓室溫等離子體誘變篩選和發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化逐步提高了菌株的β-胡蘿卜素產(chǎn)量。主要研究?jī)?nèi)容如下：①β-胡蘿卜素合成代謝途徑組裝及工程菌株構(gòu)建②產(chǎn)β-胡蘿卜素工程菌株誘變篩選③產(chǎn)β-胡蘿卜素工程菌株發(fā)酵1.5.3技術(shù)路線圖1.3技術(shù)路線Fig.1.3Technicalrouteofthisthesis

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號(hào)：3101365