棉花黃萎病是一種土傳的維管束真菌病害,被稱為棉花的“癌癥”,其致病菌為大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）。V.dahliae致病機(jī)理十分復(fù)雜且其微菌核在土壤中存活時間久,至今仍無有效的防治方法。研究V.dahliae致病過程中重要基因的功能,有助于進(jìn)一步揭示V.dahliae致病分子機(jī)制,對于棉花黃萎病的防治具有重要的指導(dǎo)意義。寄主誘導(dǎo)的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）是一種通過沉默病原菌毒力基因來防治作物病害或進(jìn)行基因功能驗證的實用有效技術(shù)。本研究利用HIGS技術(shù),以V.dahliae乙酰乳酸合成酶（VdALS）基因為靶標(biāo)構(gòu)建了一系列煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）干擾載體,對VdILV2和VdILV6的毒力功能進(jìn)行分析鑒定。并構(gòu)建VdILV2基因敲除載體,進(jìn)行了基因敲除突變株的篩選,以進(jìn)一步解析該基因在生長發(fā)育過程中的功能。主要研究結(jié)果如下:1、通過與稻瘟病菌中乙酰乳酸合成酶（ALS）同源比對,克隆了V.dahliae中ALS催化亞基和調(diào)節(jié)亞基,分別命名為VdILV2和VdILV6;生物... 

【文章來源】：河南科技學(xué)院河南省

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

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圖1-1支鏈氨基酸生物合成途徑Fig.1-1Biosynthesispathwayofthebranched-chainaminoacid

大麗輪枝菌乙酰乳酸合成酶基因VdILV2和VdILV6的克隆及功能研究10劑的作用機(jī)制有了更深入的了解；為應(yīng)對雜草的抗藥性，研發(fā)設(shè)計全新類型的靶向ALS的綠色新型除草劑，仍是一個重要并亟待解決的科學(xué)問題；同時，ALS作為抗菌藥物的靶標(biāo)值得更深入研究。圖1-2ALS及其抑制劑作用機(jī)理[92]Fig.1-2MechanismofALSanditsinhibitors1.4.4ALS在病原真菌中的研究進(jìn)展與細(xì)菌和植物相比，對真菌ALS的研究相對較少。1972年，Glatzer首次從N.crassa中分離出真菌ALS，不同物種之間ALS基因的拷貝數(shù)存在差異，有的是單拷貝，有的是多拷貝，真菌中不包含同工酶，只編碼一個ALS（核編碼的蛋白，定位于線粒體）[93]。1985年，F(xiàn)alco等在酵母（Saccharomycescerevisiae）中發(fā)現(xiàn)并克隆了ALS，在酵母中只存在1個具有功能的ALS基因[94]，后來以酵母的ALS基因為基礎(chǔ)篩選到了擬南芥中ALS基因，為人們發(fā)掘植物體內(nèi)ALS基因提供了方便[95]；酵母ALS是核內(nèi)編碼，定位于線粒體，催化亞基由ILV2編碼，調(diào)節(jié)亞基由ILV6編碼；ILV6蛋白可將ILV2蛋白的催化

大麗輪枝菌乙酰乳酸合成酶基因VdILV2和VdILV6的克隆及功能研究12或侵染的病原真菌(B10)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的沉默（圖1-3）。HIGS通常以病原菌生長、發(fā)育、侵染或者致病力所必需的基因為靶標(biāo)，真菌的一些必需基因具有保守性，只在它們的基因組中存在，這使得真菌的RNAi更具有可行性。通過構(gòu)建靶向病原菌特定基因的RNAi載體，在寄主植物內(nèi)表達(dá)RNA干擾分子，特異沉默病原菌靶標(biāo)基因，限制了病原菌生長、發(fā)育和侵染性，使寄主植株獲得對病原菌的抗性，該方法不僅可以抵御病毒入侵，在抗細(xì)菌、真菌及害蟲防治中也有良好的效果。圖1-3HIGS沉默機(jī)制[105]Figure1-3SilencingmechanismofHIGS1.5.2跨界RNA轉(zhuǎn)移機(jī)制在植物-病原體互作中，Weiberg[106]發(fā)現(xiàn)灰霉病菌（Botrytiscinerea）可以輸出sRNAs到寄主植物中沉默寄主植物的免疫防衛(wèi)基因。在隨后的研究中，在擬南芥（A.thaliana）和西紅柿中表達(dá)靶向B.cinereaDCL基因的轉(zhuǎn)錄本，結(jié)果降低了灰霉菌的生長和致病性，使寄主植物獲得了對B.cinerea的抗性[107]。但是人們并不清楚寄主產(chǎn)生的小RNA是如何轉(zhuǎn)移到病原菌中的，Nowara等（2010）提出分泌的siRNA或dsRNA可能是經(jīng)過exosomal途徑從小麥或大麥到白粉病菌并引起白粉病菌靶基因的沉默，然而，RNA是如何從植物的細(xì)胞核穿過細(xì)胞膜和細(xì)胞壁進(jìn)入到真菌細(xì)胞中的還有待進(jìn)一步確定。最近的研究證實，A.thaliana是通過分泌類外泌體囊泡（exosome-likeextracellularvesicles）來傳送寄主產(chǎn)生的sRNAs到B.cinerea中的，這些含有sRNA的囊泡在感染部位累積并被真菌細(xì)胞吸收（圖1-4），該研究為HIGS技術(shù)的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，為進(jìn)一步揭示跨界RNA轉(zhuǎn)移機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)[108]。


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