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稻瘟菌腺苷酸環(huán)化酶基因在疏棉狀菌(Thermomyces Lanuginosus)中的功能分析

發(fā)布時間:2021-03-23 06:46
  稻瘟病菌是水稻上最為重要的病害之一,它影響水稻產量和質量,每年都會造成嚴重的經(jīng)濟損失并威脅糧食安全,研究水稻稻瘟病的作用機制和相關功能有重要的科學價值和意義。腺苷酸環(huán)化酶相關蛋白是cAMP途徑的關鍵酶類,它將ATP轉化為cAMP,而cAMP是胞內第二信使,在信號傳導方面十分關鍵。稻瘟菌中的腺苷酸環(huán)化酶(CAP)被報道參與菌絲生長,產孢,附著胞形成還調控體內cAMP水平。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)十字花科炭疽菌中存在兩段與稻瘟菌MoCAP蛋白結構相近的同源蛋白,將這兩段十字花科基因分別回補至疏棉狀菌CAP突變體時,能夠不同程度的恢復其功能缺陷,發(fā)現(xiàn)兩段基因分別調控不同功能,猜測MoCAP中存在兩段不同功能的區(qū)段。借助疏棉狀菌生長迅速,產孢高效,轉化體系成熟的優(yōu)勢,我們希望通過將稻瘟菌MoCAP基因全段及分區(qū)段的回補至疏棉狀菌中,研究不同功能區(qū)段的功能,同時研究MoCAP在疏棉狀菌中的功能差異性。通過前期對疏棉狀菌CAP敲除突變體的獲得,進行了其自身基因的回補得到ΔCAP/CAP。通過與十字花科炭疽菌兩段蛋白分析對比,將稻瘟菌CAP的氮端基因(氨基酸序列1-347,下稱該片段為MoCAP-N)和碳... 

【文章來源】:吉林大學吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】:70 頁

【學位級別】:碩士

【部分圖文】:

稻瘟菌腺苷酸環(huán)化酶基因在疏棉狀菌(Thermomyces Lanuginosus)中的功能分析


潮霉素敲除載體酶切位點結構圖

原理圖,載體,策略,原理


第2章研究內容及方法295.最后將得到的L-pXEH-R載體質粒通過農桿菌轉化,轉化至農桿菌AGL-1中,并驗證轉化效果,無誤后將得到的含有L-pXEH-R載體質粒的農桿菌菌株加入等體積50%無菌甘油保存在-80℃冰箱中。圖2.2CAP敲除載體基于pXEH2.0的構建策略與原理Fig.2.2ConstructionstrategyandprincipleofCAPknockoutvectorbasedonpXEH2.02.2.6.2互補載體的構建互補載體以PKD-7定位載體為基礎進行構建,通過隨機插入的方法將互補的基因片段插入敲除突變體的基因組(圖2.3)。將需要互補的片段連接至PKD-7互補定位載體之后,通過原生質體轉化的方法,將載體導入疏棉狀菌CAP敲除突變體中。前期研究中發(fā)現(xiàn)十字花科炭疽病菌中兩個基因CH-07570和CH-14404分別于稻瘟病菌MoCAP基因的氨基酸序列氮端和碳端(相似度分別為45.72%和75.32%)。由此將稻瘟病菌MoCAP也分成兩個部分,氮端片段MoCAP-N(氨基酸序列1-347)和碳端片段MoCAP-C(氨基酸序列374-531)擬利用4個互補基因片段,疏棉狀菌全長CAP基因片段CAP;稻瘟病菌全長MoCAP基因片段MoCAP;疏稻瘟病菌MoCAP的氮端片段MoCAP-N和碳端片段MoCAP-C

視圖,載體,視圖,片段


第2章研究內容及方法30圖2.3互補載體PKD-7結構視圖Fig.2.3StructureviewofcomplementaryvectorPKD-71.互補載體的基因使用cDNA片段,首先需要培養(yǎng)疏棉狀菌和稻瘟菌野生型菌株,提取RNA,并進行反轉錄得到相應cDNA。2.同時設計引物以擴增完整的基因片段,同時加上酶切位點,互補基因需要保證準確無誤。以cDNA為模板擴增需要互補的四個片段CAP,MoCAP,MoCAP-N,MoCAP-C。將片段連接至PMD-18T載體后進行基因測序。測序結果對比原始基因序列,確保100%相符。3.無誤后,即可對相應四個片段及PDK-7載體進行酶切,酶切位點按照設計好的片段位點,確保片段能與載體準確連接。酶切過后需要進行電泳和膠回收,回收酶切后的片段進行DNA連接反應。四個片段分別與酶切好的使用不同位點的PKD-7載體進行連接。得到4份不同的連接樣品,進行大腸桿菌轉化之后,驗證確保連接無誤。4.驗證完畢連得到四個連接好的載體:PKD-7-CAP;PKD-7-MoCAP;PKD-7-MoCAP-N;PKD-7-MoCAP-C,載體構建之后需要培養(yǎng)載體菌株,提取菌株中含有的載體質粒備用。2.2.7疏棉狀菌的農桿菌介導轉化疏棉狀菌的農桿菌介導轉化在共培養(yǎng)期間使用未萌發(fā)的孢子,疏棉狀菌孢子與根癌農桿菌在28℃下共培48h,AS濃度控制在500μM[26]。1.將含有敲除載體的AGL-1菌株從-80℃冰箱中取出解凍,在50μg/ml利福平和卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)約2天直至菌液渾濁。2.接種疏棉狀菌至PDA固體培養(yǎng)基中,50℃培養(yǎng)5天至平板長滿菌絲,之后置于37℃下誘導產包7天,以備使用。3.準備完畢后開始轉化實驗,配制混合IM誘導培養(yǎng)基(見表2.6)20ml

【參考文獻】:
期刊論文
[1]農桿菌介導的獲取疏綿狀嗜熱絲孢菌插入突變體體系的建立(英文)[J]. 韓華,徐曉雪,彭延杰,孔德慧,李多川.  微生物學報. 2012(12)
[2]疏綿狀嗜熱絲孢菌原生質體的制備與再生[J]. 周慶新,陳靜,于愷,李多川.  菌物研究. 2006(02)
[3]Promoter trapping in Magnaporthe grisea[J]. 劉小紅,盧建平,王教瑜,閔航,林福呈.  Journal of Zhejiang University Science. 2006(01)
[4]REMI及其相關技術在絲狀真菌基因克隆中的應用[J]. 莫明和,徐進,張克勤.  生物技術. 2004(01)



本文編號:3095351

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