稻瘟病菌是水稻上最為重要的病害之一,它影響水稻產(chǎn)量和質(zhì)量,每年都會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失并威脅糧食安全,研究水稻稻瘟病的作用機(jī)制和相關(guān)功能有重要的科學(xué)價值和意義。腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白是cAMP途徑的關(guān)鍵酶類,它將ATP轉(zhuǎn)化為cAMP,而cAMP是胞內(nèi)第二信使,在信號傳導(dǎo)方面十分關(guān)鍵。稻瘟菌中的腺苷酸環(huán)化酶（CAP）被報道參與菌絲生長,產(chǎn)孢,附著胞形成還調(diào)控體內(nèi)cAMP水平。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)十字花科炭疽菌中存在兩段與稻瘟菌MoCAP蛋白結(jié)構(gòu)相近的同源蛋白,將這兩段十字花科基因分別回補(bǔ)至疏棉狀菌CAP突變體時,能夠不同程度的恢復(fù)其功能缺陷,發(fā)現(xiàn)兩段基因分別調(diào)控不同功能,猜測MoCAP中存在兩段不同功能的區(qū)段。借助疏棉狀菌生長迅速,產(chǎn)孢高效,轉(zhuǎn)化體系成熟的優(yōu)勢,我們希望通過將稻瘟菌MoCAP基因全段及分區(qū)段的回補(bǔ)至疏棉狀菌中,研究不同功能區(qū)段的功能,同時研究MoCAP在疏棉狀菌中的功能差異性。通過前期對疏棉狀菌CAP敲除突變體的獲得,進(jìn)行了其自身基因的回補(bǔ)得到ΔCAP/CAP。通過與十字花科炭疽菌兩段蛋白分析對比,將稻瘟菌CAP的氮端基因（氨基酸序列1-347,下稱該片段為MoCAP-N）和碳... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

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潮霉素敲除載體酶切位點(diǎn)結(jié)構(gòu)圖

第2章研究內(nèi)容及方法295.最后將得到的L-pXEH-R載體質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌AGL-1中，并驗(yàn)證轉(zhuǎn)化效果，無誤后將得到的含有L-pXEH-R載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株加入等體積50%無菌甘油保存在-80℃冰箱中。圖2.2CAP敲除載體基于pXEH2.0的構(gòu)建策略與原理Fig.2.2ConstructionstrategyandprincipleofCAPknockoutvectorbasedonpXEH2.02.2.6.2互補(bǔ)載體的構(gòu)建互補(bǔ)載體以PKD-7定位載體為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建，通過隨機(jī)插入的方法將互補(bǔ)的基因片段插入敲除突變體的基因組（圖2.3）。將需要互補(bǔ)的片段連接至PKD-7互補(bǔ)定位載體之后，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法，將載體導(dǎo)入疏棉狀菌CAP敲除突變體中。前期研究中發(fā)現(xiàn)十字花科炭疽病菌中兩個基因CH-07570和CH-14404分別于稻瘟病菌MoCAP基因的氨基酸序列氮端和碳端（相似度分別為45.72%和75.32%）。由此將稻瘟病菌MoCAP也分成兩個部分，氮端片段MoCAP-N（氨基酸序列1-347）和碳端片段MoCAP-C（氨基酸序列374-531）擬利用4個互補(bǔ)基因片段，疏棉狀菌全長CAP基因片段CAP；稻瘟病菌全長MoCAP基因片段MoCAP；疏稻瘟病菌MoCAP的氮端片段MoCAP-N和碳端片段MoCAP-C

第2章研究內(nèi)容及方法30圖2.3互補(bǔ)載體PKD-7結(jié)構(gòu)視圖Fig.2.3StructureviewofcomplementaryvectorPKD-71.互補(bǔ)載體的基因使用cDNA片段，首先需要培養(yǎng)疏棉狀菌和稻瘟菌野生型菌株，提取RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)cDNA。2.同時設(shè)計引物以擴(kuò)增完整的基因片段，同時加上酶切位點(diǎn)，互補(bǔ)基因需要保證準(zhǔn)確無誤。以cDNA為模板擴(kuò)增需要互補(bǔ)的四個片段CAP，MoCAP，MoCAP-N，MoCAP-C。將片段連接至PMD-18T載體后進(jìn)行基因測序。測序結(jié)果對比原始基因序列，確保100%相符。3.無誤后，即可對相應(yīng)四個片段及PDK-7載體進(jìn)行酶切，酶切位點(diǎn)按照設(shè)計好的片段位點(diǎn)，確保片段能與載體準(zhǔn)確連接。酶切過后需要進(jìn)行電泳和膠回收，回收酶切后的片段進(jìn)行DNA連接反應(yīng)。四個片段分別與酶切好的使用不同位點(diǎn)的PKD-7載體進(jìn)行連接。得到4份不同的連接樣品，進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化之后，驗(yàn)證確保連接無誤。4.驗(yàn)證完畢連得到四個連接好的載體：PKD-7-CAP；PKD-7-MoCAP；PKD-7-MoCAP-N；PKD-7-MoCAP-C，載體構(gòu)建之后需要培養(yǎng)載體菌株，提取菌株中含有的載體質(zhì)粒備用。2.2.7疏棉狀菌的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化疏棉狀菌的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在共培養(yǎng)期間使用未萌發(fā)的孢子，疏棉狀菌孢子與根癌農(nóng)桿菌在28℃下共培48h，AS濃度控制在500μM[26]。1.將含有敲除載體的AGL-1菌株從-80℃冰箱中取出解凍，在50μg/ml利福平和卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)約2天直至菌液渾濁。2.接種疏棉狀菌至PDA固體培養(yǎng)基中，50℃培養(yǎng)5天至平板長滿菌絲，之后置于37℃下誘導(dǎo)產(chǎn)包7天，以備使用。3.準(zhǔn)備完畢后開始轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，配制混合IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基（見表2.6）20ml

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的獲取疏綿狀嗜熱絲孢菌插入突變體體系的建立(英文)[J]. 韓華,徐曉雪,彭延杰,孔德慧,李多川.  微生物學(xué)報. 2012(12)
[2]疏綿狀嗜熱絲孢菌原生質(zhì)體的制備與再生[J]. 周慶新,陳靜,于愷,李多川.  菌物研究. 2006(02)
[3]Promoter trapping in Magnaporthe grisea[J]. 劉小紅,盧建平,王教瑜,閔航,林福呈.  Journal of Zhejiang University Science. 2006(01)
[4]REMI及其相關(guān)技術(shù)在絲狀真菌基因克隆中的應(yīng)用[J]. 莫明和,徐進(jìn),張克勤.  生物技術(shù). 2004(01)



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