本文關鍵詞：MAZ基因啟動子區(qū)順式作用元件的EMSA分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:MAZ參與細胞生理、病理狀態(tài)下多種基因的轉錄調控,被調控的基因如基質金屬蛋白酶、血清淀粉樣蛋白A等與類風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、心臟疾病、癌癥等疾病的發(fā)生密切相關。目前研究報道多集中于MAZ介導下游基因的表達調控,而有關MAZ基因的轉錄調控的研究較少見。該基因的轉錄受到其啟動子區(qū)的調控,多種轉錄因子參與其中。因此,本課題旨在通過對MAZ基因啟動子區(qū)DNA序列進行轉錄因子結合位點分析,以發(fā)現(xiàn)潛在的轉錄因子順式反應元件,并通過突變、競爭及EMSA技術研究這些順式元件,為揭示MAZ基因轉錄調控機制奠定基礎。方法:1.抽提細胞核蛋白:培養(yǎng)THP-1細胞,收集細胞,使用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒提取核蛋白,并通過BCA法進行蛋白定量。2.設計探針及生物素標記:通過PROMO軟件分析MAZ基因轉錄起始點上游948 bp DNA序列潛在的轉錄因子結合位點,設計覆蓋該序列的探針,并進行生物素標記。3.EMSA試驗:標記探針與核蛋白進行結合反應,電泳分析,轉膜及化學發(fā)光顯色。4.設計突變探針并進行EMSA分析。5.使用明確的轉錄因子結合元件進行競爭性EMSA分析。結果:1.本試驗研究的MAZ基因啟動子區(qū)DNA序列可能結合轉錄因子有40種之多,設計的32條探針僅有11條出現(xiàn)明顯的DNA與蛋白結合條帶。2.突變探針的EMSA試驗及競爭性EMSA分析結果顯示,MAZ基因啟動子區(qū)距轉錄起始點-525~-504 nt的核酸序列可與轉錄因子Elk-1在體外相結合,其順式作用元件為CTTCCCCCA。結論:本課題通過PROMO軟件分析、EMSA試驗及競爭性EMSA試驗,對人類MAZ基因SAF-1轉錄啟始點上游(-948~-1)的啟動區(qū)潛在的轉錄因子結合位置進行了篩選。初步篩選檢出一個新的轉錄因子結合位置,但尚需超遷移試驗進一步鑒定;對于進一步研究MAZ基因的轉錄機制調控提供可靠的實驗依據(jù)及EMSA技術支持。
【關鍵詞】：MAZ基因 PROMO EMSA 順式作用元件
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：D919
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 常用縮寫詞中英文對照表10-11
• 縮寫名詞附表11-12
• 前言12-14
• 1 材料14-17
• 1.1 主要儀器14
• 1.2 主要試劑及耗材14-15
• 1.3 主要配制試劑15-17
• 2 方法17-31
• 2.1 方法設計思路17
• 2.2 實驗流程17-18
• 2.3 THP-1 細胞的培養(yǎng)及核蛋白的提取18-20
• 2.3.1 THP-1 細胞的復蘇18-19
• 2.3.2 THP-1 細胞的換液與傳代培養(yǎng)19
• 2.3.3 THP-1 細胞的凍存19
• 2.3.4 THP-1 細胞核蛋白的提取19-20
• 2.3.5 BCA法測定核蛋白濃度20
• 2.4 MAZ啟動子區(qū)轉錄因子結合位點的預測及screen探針設計20-23
• 2.5 Screen probe的EMSA試驗23-26
• 2.5.1 生物素標記探針23
• 2.5.2 4.9%聚丙烯酰胺凝膠的制備23-24
• 2.5.3 EMSA結合反應——探針與核蛋白的結合24
• 2.5.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析24-25
• 2.5.5 轉膜及紫外交聯(lián)25
• 2.5.6 化學發(fā)光法檢測生物素標記探針25-26
• 2.6 突變探針的設計及EMSA實驗26-29
• 2.7 競爭性EMSA試驗29-31
• 3 結果31-37
• 3.1 MAZ啟動子區(qū)轉錄因子結合位點的軟件預測結果31-32
• 3.2 Screen probe的EMSA鑒定結果32-33
• 3.3 Mutant screen probe的EMSA鑒定結果33-34
• 3.4 Second mutant screen probe 15的EMSA鑒定結果34-35
• 3.5 Screen probe 15的競爭性EMSA結果35-37
• 4 討論37-44
• 4.1 MAZ啟動子區(qū)DNA序列的EMSA鑒定結果37-40
• 4.2 EMSA試驗成功的關鍵因素40-42
• 4.3 EMSA技術的局限性42
• 4.4 PROMO對轉錄因子結合位點的預測42-44
• 5 結論44-45
• 參考文獻45-50
• 綜述50-59
• 參考文獻54-59
• 致謝59-61
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果61-62
• 個人簡歷62

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本文編號：309092