本文關鍵詞：本氏煙鈣調素類似蛋白Nbrgs-CaM抑制轉錄后基因沉默的機理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：轉錄后基因沉默(Post transcriptional gene silencing, PTGS)是植物抵抗病毒侵染的一種機制,病毒為了成功侵染寄主植物會編碼RNA沉默抑制子。中國番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)伴隨的衛(wèi)星分子Beta (Tomato yellow leaf curl China Betasatellite, TYLCCNB)編碼的唯一蛋白pCl是一個重要的致病因子和RNA沉默抑制子。βC1可以上調本氏煙中的鈣調素類似蛋白基因Nbrgs-CaM來抑制RNA沉默途徑中的重要基因NbRDR6的表達,從而抑制RNA沉默。Nbrgs-CaM被證實是一個植物內源的RNA沉默抑制子,并在βCl抑制次級小型干擾RNAs (Small interfering RNAs, siRNAs)的產生及誘導雙生病毒的致病性中起了重要作用。植物病毒利用Nbrgs-CaM來反擊寄主的防御反應,但是Nbrgs-CaM抑制RNA沉默的具體作用尚不清楚。本文圍繞著Nbrgs-CaM與本氏煙沉默抑制子(Suppressor of Gene Silencing 3, NbSGS3)的互作開展深入的研究。NbSGS3在細胞內呈顆粒狀分布,這種顆粒狀結構被稱為SGS3/RDR6小體(SGS3/RDR6 bodies)。對NbSGS3序列進行分析,發(fā)現(xiàn)它具有三個典型的結構域。為了明確它的哪一個結構域對于這種顆粒狀的定位是必需的,我們分別構建了NbSGS3的各個結構域缺失突變體的亞細胞定位表達載體(pCHF3-NbSGS3-dZF-GFP, pCHF3-NbSGS3-dXS-GFP, pCHF3-NbSGS3-d2CC-GFP)。通過浸潤H2B-RFP本氏煙,觀察它們的亞細胞定位模式,我們發(fā)現(xiàn)NbSGS3的ZF和2CC結構域對于它的亞細胞定位很重要。為了探究NbSGS3的關鍵定位結構域是否也是它與Nbrgs-CaM的互作結構域,我們構建了NbSGS3的各個結構域缺失突變體的BiFC表達載體(2YN/2YC-NbSGS3-dZF, 2YN/2YC-NbSGS3-dXS,2YN/2YC-NbSGS3-d2CC)。通過在H2B-RFP本氏煙上共表達這些突變體蛋白,分析它們與Nbrgs-CaM蛋白在細胞內的互作情況,結果顯示NbSGS3的ZF和2CC結構域對于它與Nbrgs-CaM的互作也是必需的。對Nbrgs-CaM的序列進行分析,發(fā)現(xiàn)它具有四個功能結構域。為了探究Nbrgs-CaM的哪個結構域決定了它與NbSGS3的互作,我們構建了Nbrgs-CaM的各個結構域缺失突變體的BiFC表達載體(2YN/2YC-NbCaM-dX,2YN/2YC-NbCaM-dEFI,2YN/2YC-NbCaM-dEFII,2YN/2YC-NbCaM-dEFIV)。在H2B-RFP本氏煙上研究Nbrgs-CaM不同結構域的缺失突變體與NbSGS3蛋白的互作情況,結果顯示Nbrgs-CaM的EFI和EFII兩個結構域對于它與NbSGS3的互作是必需的。為了明確Nbrgs-CaM與NbSGS3的互作結構域EFI和EFII對于Nbrgs-CaM的PTGS抑制子活性是否同樣重要,我們將Nbrgs-CaM及其各個結構域缺失突變體構建到pCambia2300-Flag的重組表達載體上(pCambia2300-NbCaM-dX-Flag, pCambia2300-NbCaM-dEFI-Flag, pCambia2300-NbCaM-dEFII-Flag,pCambia2300-NbCaM-dEFIV-Flag)。分別在野生型本氏煙和16c本氏煙上進行RNA沉默抑制子鑒定實驗,結果均顯示Nbrgs-CaM與NbSGS3互作所必需的EFI和EFII兩個結構域對于Nbrgs-CaM的沉默抑制子功能也是必需的。我們還發(fā)現(xiàn)Nbrgs-CaM的過量表達能夠降低NbSGS3蛋白的積累量。這些結果說明Nbrgs-CaM可以與NbSGS3互作并降解NbSGS3蛋白的表達從而抑制RNA沉默。
【關鍵詞】：中國番茄黃化曲葉病毒 βC1蛋白 鈣調素類似蛋白Nbrgs-CaM 基因沉默抑制子3 NbSGS3 轉錄后基因沉默
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S432.41
【目錄】：

• 致謝6-8
• 摘要8-10
• Abstract10-16
• 1 緒論16-30
• 1.1 雙生病毒的發(fā)生情況與危害程度16
• 1.2 雙生病毒的分類和基因組結構16-20
• 1.2.1 菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus)18-19
• 1.2.2 玉米線條病毒屬(Mastrevirus)19
• 1.2.3 甜菜曲頂病毒屬(Curtovirus)19-20
• 1.2.4 番茄偽曲頂病毒屬(Topocuvirus)20
• 1.2.5 伊朗甜菜曲頂病毒屬(Becurtovirus)20
• 1.2.6 蕪菁曲頂病毒屬(Turncurtovirus)20
• 1.2.7 彎葉畫眉草條紋病毒屬(Eragrovirus)20
• 1.3 菜豆金色花葉病毒屬病毒betasatellite的研究進展20-21
• 1.4 雙生病毒與RNA沉默21-28
• 1.4.1 RNA沉默機制21-22
• 1.4.2 RNA沉默途徑中的抗病毒侵染的核心蛋白22-23
• 1.4.3 雙生病毒誘發(fā)的RNA沉默23-24
• 1.4.4 雙生病毒編碼的RNA沉默抑制子24-28
• 1.5 基因沉默抑制子SGS3的研究進展28
• 1.6 鈣調素類似蛋白Rgs-CaM的研究進展28-29
• 1.7 本項目的研究目的和研究意義29-30
• 2 實驗方法30-49
• 2.1 常規(guī)DNA克隆技術30-37
• 2.1.1 PCR技術30-33
• 2.1.2 PCR產物的回收33
• 2.1.3 加A反應33-34
• 2.1.4 連接34
• 2.1.5 感受態(tài)細胞的制備34-35
• 2.1.6 轉化35
• 2.1.7 菌落PCR篩選35-36
• 2.1.8 重組質粒的提取36
• 2.1.9 重組質粒的酶切驗證36-37
• 2.1.10 重組克隆的測序鑒定37
• 2.2 重組質粒導入根癌農桿菌及接種37-38
• 2.2.1 根癌農桿菌感受態(tài)細胞的制備37
• 2.2.2 重組質粒電擊轉化根癌農桿菌37-38
• 2.2.3 農桿菌的浸潤接種38
• 2.3 植物總DNA提取以及Southern blot分析38-43
• 2.3.1 CTAB法大量抽提植物DNA的方法38-40
• 2.3.2 CTAB法小量抽提植物DNA的方法40
• 2.3.3 Southern印跡分析40-43
• 2.4 植物總RNA小量提取、RT-PCR、RT-qPCR、Northern雜交43-46
• 2.4.1 植物總RNA的小量提取43-44
• 2.4.2 反轉錄RT-PCR及RT-qPCR44-45
• 2.4.3 Northern印跡雜交45-46
• 2.5 植物總蛋白的提取、蛋白的SDS-PAGE及Western blot雜交46-49
• 2.5.1 植物總蛋白的提取46
• 2.5.2 蛋白的SDS-PAGE46-47
• 2.5.3 Western blot分析技術47-49
• 3 Nbrgs-CaM與NbSGS3互作結構域及Nbrgs-CaM抑制子結構域鑒定49-68
• 3.1 材料與方法49-55
• 3.1.1 實驗材料49
• 3.1.2 載體的構建49-51
• 3.1.3 農桿菌介導的浸潤與接種51
• 3.1.4 GFP熒光記錄及樣品采集51-52
• 3.1.5 Western blot分析GFP蛋白的表達量52
• 3.1.6 Northern blot分析52-55
• 3.2 結果與分析55-66
• 3.2.1 ZF和2CC結構域對NbSGS3亞細胞定位很重要55-57
• 3.2.2 ZF和2CC結構域對于NbSGS3與Nbrgs-CaM的互作很重要57-59
• 3.2.3 EFⅠ和EFⅡ是Nbrgs-CaM與NbSGS3的互作結構域59-61
• 3.2.4 在野生型本氏煙中鑒定Nbrgs-CaM缺失突變體的抑制子活性61-63
• 3.2.5 在16C本氏煙中鑒定Nbrgs-CaM缺失突變體的抑制子活性63-65
• 3.2.6 Nbrgs-CaM蛋白介導NbSGS3蛋白的降解65-66
• 3.3 討論66-68
• 4 全文小結68-69
• 附文 TYLCCNB編碼的pC1蛋白與NbPsbP的互作機理研究69-90
• 1 緒論69-71
• 2 材料與方法71-75
• 2.1 實驗材料71
• 2.2 NbPsbP沉默載體的構建71-72
• 2.3 常溫包埋樣品制備以及電鏡觀察細胞結構72
• 2.4 雙分子熒光互補實驗(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)72-73
• 2.4.1 重組質粒電擊轉化農桿菌72
• 2.4.2 農桿菌接種72-73
• 2.4.3 激光共聚焦顯微鏡觀察互作結果73
• 2.5 酵母雙雜交實驗73-74
• 2.5.1 酵母雙雜交驗證兩種已知蛋白的互作73-74
• 2.5.2 酵母蛋白的提取74
• 2.6 NbPsbP總蛋白的提取及Western blot74
• 2.7 NbPsbP總RNA提取、RT-PCR、RT-qPCR及Northern blot74-75
• 3 結果與分析75-90
• 3.1 TYLCCNB編碼的βC1蛋白可以引起本氏煙葉綠體變形75-77
• 3.2 TYLCCNB編碼的βC1蛋白與NbPsbP蛋白互作77-81
• 3.2.1 BiFC驗證βCl蛋白與NbPsbP蛋白的互作77-79
• 3.2.2 酵母雙雜交驗證pC1蛋白與NbPsbP蛋白的互作79-81
• 3.3 NbPsbP定位于葉綠體81-83
• 3.4 雙生病毒10Aβ的侵染顯著上調NbPsbP mRNA的表達量83-84
• 3.5 βC1轉基因本氏煙中NbPsbP mRNA表達量上調84-85
• 3.6 NbPsbP基因對10Aβ病毒致病性的影響85-88
• 3.6.1 NbPsbP基因沉默表型和沉默水平85-86
• 3.6.2 沉默NbPsbP基因會減輕10Aβ癥狀并減少病毒的積累量86-88
• 3.7 討論88-90
• 參考文獻90-97
• 附錄A：本論文所用縮寫詞及中英文對照97-99
• 附錄B：本論文所用病毒縮寫及中英文對照99-100
• 附錄C：常用緩沖液及培養(yǎng)基配方100-105

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本文編號：308885