β-甘露聚糖酶（beta-mannanase）是一種水解類酶,能夠隨機(jī)切割線性甘露聚糖,半乳甘露聚糖,葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖等主鏈的β-1,4-D-甘露糖甘鍵。由于β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖的價(jià)值和需求,來源于微生物的β-甘露聚糖酶的化學(xué)特性和結(jié)構(gòu)性質(zhì),以及在各種應(yīng)用被廣泛而深入的研究。β-甘露聚糖酶可以應(yīng)用在紙漿漂白、降低咖啡粘度、洗滌劑配方和食品和動(dòng)物飼料等領(lǐng)域中。因此,對β-甘露聚糖酶進(jìn)行異源表達(dá),分離純化以及酶學(xué)性質(zhì)探究具有重要的研究意義。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室篩選產(chǎn)氣腸桿菌B19菌株的16S rDNA,利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST功能在線比對16S rDNA,得到同源性較高的Enterobacter cloacae P101中的β-甘露聚糖酶基因序列,故以該菌株的β-甘露聚糖酶基因全長序列為模板,通過構(gòu)建克隆載體,擴(kuò)增并獲得β-甘露聚糖酶的基因序列,將驗(yàn)證正確的β-甘露聚糖酶基因構(gòu)建到pET28a（+）表達(dá)載體上,以大腸桿菌BL21（DE3）作為β-甘露聚糖酶異源表達(dá)的宿主菌,成功表達(dá)出β-甘露聚糖酶。通過Ni柱親和層析法分離純化得到純度較高的β-甘露聚糖酶,該酶蛋白的分子大小... 

【文章來源】：華南理工大學(xué)廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

不同類型甘露聚糖的結(jié)構(gòu)：(a)線性甘露聚糖；(b)葡甘露聚糖；(c)半乳甘露聚糖；(d)半乳葡甘露聚糖；甘露糖；葡萄糖；半乳糖

ies 團(tuán)隊(duì)根據(jù)糖苷水解酶的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)信息，發(fā)現(xiàn)糖苷鍵的水解是由兩個(gè)接觸殘基實(shí)現(xiàn)的。通常一個(gè)是作為質(zhì)子的供體酸性氨基酸和一個(gè)親[6]，基于這些研究提出了一個(gè)通用的糖苷水解酶催化機(jī)制[7]。根據(jù)催化殘不同，糖苷水解酶主要有兩種催化機(jī)制：保留機(jī)制(Retaining MechanismsInverting Mechanisms)[8]。這兩種催化機(jī)制都是通過處于催化活性位點(diǎn)上的酸或天冬氨酸）以酸堿催化方式進(jìn)行催化的。來源的 β-甘露聚糖酶對不同底物的作用方式有所差別，β-甘露聚糖酶的具圖 1-2。β-甘露聚糖酶在催化反應(yīng)過程符合雙替位機(jī)制，在反應(yīng)過程中有基分別充當(dāng)親核催化位點(diǎn)和酸堿催化位點(diǎn)。一個(gè)谷氨酸作為親核基團(tuán)進(jìn)攻原子，使糖苷鍵斷裂形成共價(jià)中間體；另一個(gè)谷氨酸在催化過程中先進(jìn)行質(zhì)子穩(wěn)定中間體，再進(jìn)行堿催化，將水分子去質(zhì)子化，最后完成水解過程糖酶催化機(jī)制如圖 1-3。

圖 1-3：β-甘露聚糖的催化反應(yīng)原理（引自 Hilge[9]）Fig.1-3 Catalytic mechanism of beta-mannanase (quoted from Hilge[9])1.2.3 β-甘露聚糖酶的來源及性質(zhì)β-甘露聚糖酶廣泛的存在于動(dòng)植物及微生物中，但目前進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)的 β糖酶大都來源于微生物，特別是細(xì)菌和真菌。微生物產(chǎn)生的 β-甘露聚糖酶具有種活性高、易分離純化、穩(wěn)定性好、溫度和 pH 作用范圍廣和底物專一性強(qiáng)等顯著特因此微生物來源的 β-甘露聚糖酶更易于廣泛應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)和基礎(chǔ)研究中。β-甘露聚糖酶由一個(gè)或多個(gè)亞基組成，酶蛋白的分子量之間存在很大的差異的 β-甘露聚糖酶包含了 1300 多個(gè)氨基酸殘基，而最短的則只有 31 個(gè)氨基酸殘生活環(huán)境和生存方式等方面不同的生物產(chǎn)生 β-甘露聚糖酶，在分子量、溫度及 最適作用范圍和穩(wěn)定性、等電點(diǎn)、酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)、底物專一性等結(jié)構(gòu)或性質(zhì)上都大的差異。

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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本文編號：3088131