木霉屬真菌在生物降解和生物防治方面有巨大的應(yīng)用潛力,而其中棘孢木霉（Trichoderma asperellum）因生長迅速、抗生能力強(qiáng)、對農(nóng)作物的生長有更全面地輔助作用等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物防治和降解方面。然而木霉菌的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量較低,特異性強(qiáng),抗生產(chǎn)物的調(diào)控機(jī)制研究不深等問題限制了木霉的應(yīng)用,基于這種情況,本論文的主要目的是為了確定棘孢木霉T4的主要抗生蛋白之一,內(nèi)切幾丁質(zhì)酶ech42基因的調(diào)控因子與幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)物質(zhì)的轉(zhuǎn)入方式,并采用基因工程和發(fā)酵工程的方法,提高棘孢木霉T4包括ech42蛋白在內(nèi)的的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量,從而強(qiáng)化棘孢木霉抵抗病蟲害的能力,進(jìn)一步挖掘其作為生物防治菌的價(jià)值。在確定棘孢木霉T4（Trichoderma asperellum T4）有降解幾丁質(zhì)的能力之后,通過PCR獲得ech42啟動(dòng)子區(qū)序列,用生物素Biotin對其進(jìn)行標(biāo)記之后將其與幾丁質(zhì)為唯一碳源的條件下生長的木霉T4的總蛋白反應(yīng)獲得特異性結(jié)合的蛋白;將這些蛋白收集并質(zhì)譜測序后確定調(diào)控子蛋白為cdk5/pho85。利用RNA干擾和過表達(dá)的方法改變cdk5/pho85的基因表達(dá)量之后,結(jié)果顯示相比較于野生型,... 

【文章來源】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：153 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

細(xì)菌內(nèi)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)示意圖

在微生物幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)調(diào)控的研究上,仍然是細(xì)菌方面的研究相對最多。細(xì)菌的幾丁質(zhì)降解受多種蛋白控制,幾丁質(zhì)酶的分泌也受多種調(diào)控子調(diào)控,目前研究最多的有如下幾類:總體調(diào)節(jié)因子、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)、調(diào)節(jié)蛋白與啟動(dòng)子結(jié)合蛋白[39,40]。多效調(diào)節(jié)因子DasR在2002年就已經(jīng)被報(bào)道是轉(zhuǎn)錄阻遏因子,該因子調(diào)控多種幾丁質(zhì)酶的表達(dá)。有文獻(xiàn)利用計(jì)算機(jī)模擬以及體外實(shí)驗(yàn)證明DasR與PTS系統(tǒng)的多個(gè)基因有應(yīng)答關(guān)系,且DasR在這些蛋白的啟動(dòng)子區(qū)都有結(jié)合位點(diǎn),但磷酸葡糖胺能夠解除抑制效應(yīng),有科學(xué)家因此認(rèn)為磷酸葡糖胺是去阻遏功能的重要物質(zhì)[141]。2007年,Saito等發(fā)現(xiàn)幾丁寡糖調(diào)控dasR的轉(zhuǎn)錄,但幾丁單糖卻不能,因此許多科學(xué)家認(rèn)為DasR是多功能調(diào)節(jié)因子,如同CRE1蛋白,不同之處在于DasR必須和轉(zhuǎn)錄蛋白結(jié)合之后才能影響幾丁質(zhì)酶表達(dá)[142]。最早ChiS/ChiR雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)是在1999年,熱紫鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)[143]。有研究將幾丁質(zhì)酶chi40、chis及chir三個(gè)基因轉(zhuǎn)入淺青鏈霉菌中,發(fā)現(xiàn)酶活效果結(jié)果比單一轉(zhuǎn)化chi40效果要高,很明顯chis和chir對于幾丁質(zhì)酶chi40有刺激作用[144]:ChiS蛋白是感受胞外物質(zhì)的感受器;而ChiR蛋白在胞內(nèi)與DNA相互作用,從而調(diào)節(jié)后續(xù)表達(dá)。這兩種蛋白構(gòu)成的雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)下游幾個(gè)幾丁質(zhì)酶的表達(dá)[145]。如圖1-2所示:當(dāng)胞外沒有幾丁寡糖時(shí),DasA會(huì)與ChiS在細(xì)胞膜上結(jié)合,ChiS此時(shí)處于未激活狀態(tài),系統(tǒng)靜止;當(dāng)胞外有幾丁寡糖時(shí),寡糖與ChiS競爭性結(jié)合DasA,DasA不與ChiS結(jié)合時(shí)ChiS處于激活狀態(tài);ChiS將自身磷酸化之后將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至ChiR并將其激活,激活的ChiR可以結(jié)合在幾丁質(zhì)基因的啟動(dòng)子上,啟動(dòng)幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)[146]。當(dāng)chiR基因缺失后幾丁質(zhì)酶受幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的程度顯著降低,酶活力與野生型相比沒有顯著變化。這可能是由于雙組分系統(tǒng)只能調(diào)節(jié)自身下游幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá),其它幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)不受影響,因此其他幾丁質(zhì)酶可能會(huì)增加表達(dá)量以彌補(bǔ)損失[147]。

研究技術(shù)路線

【參考文獻(xiàn)】：
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博士論文
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本文編號：3071097