磷脂酶A₂（PLA₂）是蛇毒中的重要毒素,具有神經(jīng)毒、肌肉毒、血液毒性等,并可以引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。蛇血清中存在蛇毒PLA₂天然抑制蛋白（PLA₂inhibitor,PLI）,可以保護(hù)蛇機(jī)體免于中毒。其中γ型PLI是分布最廣、報(bào)道最多的PLI。PLIγ在有毒蛇和無(wú)毒蛇中均有表達(dá),但不同的蛇源PLIγ抗毒活性有較大的差異,具體原因尚不清楚。目前研究報(bào)道的PLIγ僅停留在從蛇血液中分離純化以及活性的證明上,對(duì)結(jié)構(gòu)的研究不多。本文以兩種高活性的華游蛇PLIγ（SaPLIγ）和王錦蛇的PLIγ（EcPLIγ）為親本,采取DNA改組的方法,將兩種PLIγ進(jìn)行基因重組,利用噬菌體表面展示技術(shù)淘選高活性的改組PLIγ。目的:通過(guò)基因改組的定向進(jìn)化策略和噬菌體表面展示技術(shù),對(duì)PLIγ進(jìn)行改組并篩選獲得更高活性的PLIγ,探討關(guān)鍵氨基酸序列、局部結(jié)構(gòu)與PLIγ活性的關(guān)系。方法:（1）取新鮮的華游蛇、王錦蛇肝臟,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,利用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到兩種親本PLIγ基因,并測(cè)序。（2）將SaP... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

基因改組原理圖

圖 2 DNA 改組過(guò)程中產(chǎn)物的檢測(cè)與華游蛇 PLIγ 電泳鑒定. M:100 bp DNA Marker，1.王錦蛇 PLIγ，2.華游蛇 PLLIγ 水解產(chǎn)物瓊脂糖電泳。M:50bp DNA Marker。c.無(wú)引物 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電p DNA Marker。d.PLIγ 有引物 PCR 擴(kuò)增，獲得了大小為 550bp 條帶。M:100bp DCANTAB5e-cPLIγ 重組載體驗(yàn)證改組的 cPLIγ 和噬菌粒載體 pCANTAB5e 先后經(jīng)過(guò) sfi I 和 Not I 雙酶 T4 連接酶連接，連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 TG1 感受態(tài)細(xì)胞 均勻涂到 YT-A 固體培養(yǎng)基上，隨機(jī)挑取 10 個(gè)單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng) 和雙酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖 3。十個(gè)單克隆菌落 PCR 表明均為陽(yáng)性克�。盖需b定可以看到有 4500bp 和 550bp 兩個(gè)條帶，Not I 單酶切泳道（泳道）僅一個(gè)條帶，分子量約為 5000bp，結(jié)果表明質(zhì)粒構(gòu)建成功，初可以用于后續(xù)噬菌體的篩選。

進(jìn)行 PCR 和雙酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖 3。十個(gè)單克隆菌落 PCR 表明均為陽(yáng)性克�。▓D3A）。雙酶切鑒定可以看到有 4500bp 和 550bp 兩個(gè)條帶，Not I 單酶切泳道（圖3B 第四泳道）僅一個(gè)條帶，分子量約為 5000bp，結(jié)果表明質(zhì)粒構(gòu)建成功，初級(jí)基因庫(kù)可以用于后續(xù)噬菌體的篩選。圖 3 重組質(zhì)粒的 PCR 和酶切驗(yàn)證AB→500bpA：重組質(zhì)粒 PCR 鑒定。菌落 PCR 產(chǎn)物與理論值相符。B：重組質(zhì)粒酶切鑒定。M， 1kb DNAMarker，1-3 Sfi I 和 Not I 雙酶切結(jié)果，4，Not I 單酶切結(jié)果。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]華游蛇PLIγ模擬肽的設(shè)計(jì)與活性驗(yàn)證[J]. 鐘立鵬,郭薇,姚敏,沈婷,楊武,黃春洪.  基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床. 2014(03)
[2]基于Autodock和蛇PLIγ設(shè)計(jì)短肽sPLA2抑制劑[J]. 鐘立鵬,姚敏,樂(lè)貞,黃春洪.  南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(理科版). 2013(04)
[3]蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 蘇怡丹,伍寧豐,劉國(guó)安.  生物技術(shù)通報(bào). 2009(11)
[4]DNA改組及其應(yīng)用研究[J]. 趙翠燕,許欽坤,柯野.  當(dāng)代生態(tài)農(nóng)業(yè). 2009(Z1)
[5]烏梢蛇血清對(duì)白眉蝮等3種蛇毒解毒作用初探[J]. 胡愷,萬(wàn)新華,劉岱岳.  蛇志. 2006(03)
[6]王錦蛇血清對(duì)尖吻蝮蛇毒的抑制作用[J]. 黃松,黃接棠.  蛇志. 2005(04)
[7]利用DNA家族重排提高青霉素G�；负铣苫盍Γㄓ⑽模J]. 周政,張愛(ài)暉,王晶茹,陳茂林,李仁寶,楊晟,袁中一.  生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào). 2003(06)



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