藏紅花（Crocus sativus L.）作為一種名貴的中藥材,以柱頭所含豐富且特殊的類胡蘿卜素物質(zhì)被稱為“植物黃金”。藏紅花僅以柱頭入藥,人們始終希望通過各種方式解決其應(yīng)用的資源瓶頸問題。已經(jīng)闡明藏紅花類胡蘿卜素合成途徑和相關(guān)基因,在此基礎(chǔ)上本論文通過克隆藏紅花柱頭中類胡蘿卜素合成的幾個關(guān)鍵酶基因、并構(gòu)建大腸桿菌的表達(dá)體系研究藏紅花類胡蘿卜素的合成問題。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法獲得了藏紅花柱頭表達(dá)的CsZCD（玉米黃素裂解酶基因）、CsCCD2（類胡蘿卜素裂解雙加氧酶2基因）以及醛脫氫酶（CsALDH）基因家族的CsALDH2、CsALDH3、CsALDH5、CsALDH6類胡蘿卜素合成相關(guān)基因。采用同源重組的方法構(gòu)建得到pET28a-Crt-ZCD和pET28a-Crt-CCD2玉米黃素合成載體以及pTRI-P-ALDH2、pTRI-P-ALDH3、pTRI-P-ALDH5、pTRI-P-ALDH6誘導(dǎo)型和組成型共12個表達(dá)型載體。在此基礎(chǔ)上將質(zhì)粒pET28a-Crt-ZCD或pET28a-Crt-CCD2單獨以及分別與載體pTRI-P-ALDH2、pTRI-P-ALDH3... 

【文章來源】：上海師范大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

藏紅花中主要類胡蘿卜素及結(jié)構(gòu)式（BukhariSetal.,2018Biomedicine&Pharmacotherapy）

上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章引言5種裂解雙加氧酶，負(fù)責(zé)裂解步驟，導(dǎo)向從前體玉米黃質(zhì)開始的藏紅花酸生物合成。CCD2和ZCD的功能在藏紅花合成途徑中是相同的。圖1-2玉米黃素合成藏紅花素過程(Frusciante,S.,etal.,2014)由于擬南芥在分子克隆和基因編輯上的優(yōu)勢以及強(qiáng)大的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)工具，使得擬南芥中的類胡蘿卜素合成也被探究[38]。早在2006年，Schmidt,HolgerHolger.SchmidtMytum.等人就通過氣相和液相色譜-質(zhì)譜以及核磁共振分析等方法證明了AtCCD1這種類胡蘿卜素裂解酶在擬南芥中的裂解機(jī)制[39]。藏紅花素合成的一些關(guān)鍵酶基因也在擬南芥中存在。例如PSY基因，通過一些生物技術(shù)方法，如組織特異性PSY過度表達(dá)，成功地增加了與農(nóng)業(yè)相關(guān)的非綠色植物組織中的類胡蘿卜素含量[40]。如圖1-3所示[41]在擬南芥中類胡蘿卜素主要是由MEP途徑產(chǎn)生的IPP和DMAPP合成的，向DMAPP中添加三個IPP分子可生成GGPP，它是包括類胡蘿卜素在內(nèi)的幾種質(zhì)體類異戊二烯的前體，類胡蘿卜素生物合成的第一步是通過兩個GGPP分子的縮合產(chǎn)生40個碳的八氫番茄紅素，這種由八氫番茄紅素合成酶（PSY）催化的反應(yīng)被認(rèn)為是類胡蘿卜素途徑中的關(guān)鍵性因素，八氫番茄紅素經(jīng)過去飽和和異構(gòu)化產(chǎn)生番茄紅素。番茄紅素末端的環(huán)化形成-胡蘿卜素或者-胡蘿卜素，這也是這條合成途徑的第一個分支點。胡蘿卜素經(jīng)過羥基化分別形成葉黃素和玉米黃素，這些類胡蘿卜素經(jīng)過進(jìn)一步的修飾在擬南芥及其他植物中產(chǎn)生多種類胡蘿卜素。另外類胡蘿卜素作為重要激素的前體可以進(jìn)入多種途徑，如

第一章引言上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文101.5細(xì)菌中類胡蘿卜素合成研究目前藏紅花類胡蘿卜素的合成途徑已經(jīng)被部分闡明，并且隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，在微生物中導(dǎo)入異源目的基因合成酶或其他發(fā)酵產(chǎn)物的研究已經(jīng)較為成熟。所以通過微生物發(fā)酵合成藏紅花類胡蘿卜素也成為傳統(tǒng)方法之外的最有前景的研究方法。光合細(xì)菌是一種可進(jìn)行原始光能合成的原核生物，現(xiàn)已知的可以利用光合細(xì)菌進(jìn)行合成的類胡蘿卜素有80多種[56]。紅假單胞菌和紅桿菌常用來研究，可以通過優(yōu)化培養(yǎng)基來提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量。Marasco,ErinK研究了五個不同的藍(lán)細(xì)菌中的類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（CCD）同源基因在大腸桿菌中的裂解活性，在一種藍(lán)細(xì)菌中鑒定出的類胡蘿卜素裂解活性的多樣性表明，CCD不僅促進(jìn)光合色素的降解，而且還產(chǎn)生載脂體素[57]。大腸桿菌具有清晰的遺傳背景，在簡單的培養(yǎng)條件下生長速度快，并且有許多成熟的大規(guī)模發(fā)酵技術(shù)。因此，它受到代謝工程研究人員的強(qiáng)烈支持，目前更多研究人員利用大腸桿菌這種工程菌來研究類胡蘿卜素的合成。研究人員根據(jù)光合細(xì)菌莢膜紅桿菌的類胡蘿卜素生物合成基因，構(gòu)建了含有六個開放閱讀框的質(zhì)粒pCAR25，分別是crtE、crtX、crtY、crtI、crtB和crtZ基因；只有crtZ與其他基因的方向相反，其中crtE是植物中PSY基因的同源基因，crtZ是β-胡蘿卜素羥化酶，合成途徑見圖1-4。通過對表達(dá)這6個基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子中積累的類胡蘿卜素的分析，闡明了MEP的類胡蘿卜素生物合成途徑[58]。并通過薄層層析等手段鑒定大腸桿菌的產(chǎn)物，得到了類胡蘿卜素。圖1-4光合細(xì)菌中類胡蘿卜素的合成途徑及產(chǎn)物

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]產(chǎn)藏紅花酸的人工酵母細(xì)胞的構(gòu)建[D]. 梅雪昂.天津大學(xué) 2016
[2]不同紅酵母發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素的研究[D]. 李偉昆.大連工業(yè)大學(xué) 2015
[3]迎春花黃色素的提取及抗氧化作用的研究[D]. 唐琳.山東師范大學(xué) 2006
[4]鹽藻中β-胡蘿卜素及多糖的研究[D]. 隋曉.中國海洋大學(xué) 2005
[5]萬壽菊黃色素的提取及性質(zhì)研究[D]. 陳利梅.華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué) 2004



本文編號：3033342