細菌的群體感應系統(tǒng)中,自誘導物通常并非常見的代謝中間產(chǎn)物,而是自身分泌的特定小分子物質(zhì)。硫化氫（H2S）作為微生物產(chǎn)生的一種內(nèi)源性小分子物質(zhì),具有自由跨膜的特性。大腸桿菌釋放的H2S主要由3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3-MST）途徑產(chǎn)生。以大腸桿菌為研究對象,我們發(fā)現(xiàn)作為第三類氣體信號分子的H2S與菌體密度線性相關,而與大腸桿菌的種類、培養(yǎng)基類型以及培養(yǎng)基pH值無關。從動態(tài)調(diào)控工程的角度,H2S符合群體感應信號分子的特征,于是我們設計并構(gòu)建了基于H2S信號分子的群體感應型基因回路。動態(tài)調(diào)控基因回路涉及幾個關鍵元件:信號轉(zhuǎn)換器-信號感受器-啟動器。硫醌氧化還原酶（SQR）是定位于質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的一種硫氧化蛋白,其功能是氧化H2S生成硫烷硫（HSnH,n>2）,相比于H2S的自由穿膜,生成的HSnH會保存于胞內(nèi),因此SQR可以充當信號轉(zhuǎn)換器的角色,將胞外H2S信號轉(zhuǎn)換成胞內(nèi)HSnH信號。由于大腸桿菌自身并不含有SQR,故將PpSQR和CpSQR分別在大腸桿菌中異源表達并檢測其功能。結(jié)果顯示二者都可以在大腸桿菌中正常發(fā)揮作用,但酶活具有差異顯著。目前研究發(fā)現(xiàn)自然界存在多個能特異性感應硫烷硫的轉(zhuǎn)錄... 

【文章來源】：山東大學山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號說明
第一章 緒論
    1.1 引言
2S簡介">    1.2 H₂S簡介
2S的理化性質(zhì)及生理功能">        1.2.1 H₂S的理化性質(zhì)及生理功能
2S的轉(zhuǎn)運機制">        1.2.2 H₂S的轉(zhuǎn)運機制
2S在生物體內(nèi)的產(chǎn)生途徑">        1.2.3 H₂S在生物體內(nèi)的產(chǎn)生途徑
2S的生物氧化">        1.2.4 H₂S的生物氧化
2S的檢測">        1.2.5 H₂S的檢測
    1.3 硫烷硫簡介
        1.3.1 硫烷硫的理化性質(zhì)及生理功能
        1.3.2 硫烷硫的產(chǎn)生
        1.3.3 硫烷硫的檢測
    1.4 硫氧化相關調(diào)控因子
        1.4.1 BigR
        1.4.2 CstR
        1.4.3 SqrR
        1.4.4 FisR
    1.5 群體感應系統(tǒng)與動態(tài)代謝調(diào)控
        1.5.1 群體感應
        1.5.2 動態(tài)代謝調(diào)控
    1.6 本論文的研究內(nèi)容和意義
2S與菌體密度關系的研究">第二章 H₂S與菌體密度關系的研究
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 試劑和試劑盒
        2.1.3 儀器設備
        2.1.4 培養(yǎng)基和緩沖液
    2.2 實驗方法
        2.2.1 生長曲線的測定
        2.2.2 培養(yǎng)基pH的恒定
2S">        2.2.3 HPLC法檢測H₂S
        2.2.4 SSP4法檢測胞內(nèi)多硫化物
    2.3 結(jié)果與討論
2S釋放量與大腸桿菌菌體密度線性相關">        2.3.1 H₂S釋放量與大腸桿菌菌體密度線性相關
2S菌體密度相關性的影響">        2.3.2 不同遺傳背景的菌株對H₂S菌體密度相關性的影響
2S菌體密度相關性的影響">        2.3.3 不同培養(yǎng)基對H₂S菌體密度相關性的影響
2S菌體密度相關性的影響">        2.3.4 pH值對H₂S菌體密度相關性的影響
    2.4 本章小結(jié)
第三章 群體感應型基因回路的構(gòu)建
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 本章所用引物
        3.1.3 試劑和試劑盒
        3.1.4 儀器設備
        3.1.5 培養(yǎng)基和緩沖液
    3.2 實驗方法
        3.2.1 E.coli TSB法感受態(tài)的制備（KCM法）
        3.2.2 E.coli電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備
        3.2.3 E.coli熱擊感受態(tài)的制備（化學感受態(tài)）
        3.2.4 多硫化物的制備及濃度檢測
        3.2.5 熒光報告系統(tǒng)的構(gòu)建
        3.2.6 多硫化物的外源添加誘導
2O₂的外源添加誘導">        3.2.7 H₂O₂的外源添加誘導
        3.2.8 生長周期及熒光值的酶標儀檢測
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 信號轉(zhuǎn)換器的篩選
        3.3.2 信號感受器的篩選
        3.3.3 信號感受器與啟動器的組裝
        3.3.4 完整基因回路的組裝與測試
        3.3.5 完整基因回路具有同步性和穩(wěn)定性
        3.3.6 遺傳背景、轉(zhuǎn)換器效率等因素對基因回路的影響
    3.4 本章小結(jié)
第四章 群體感應型基因回路的應用研究
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株和質(zhì)粒
        4.1.2 本章所用引物
        4.1.3 試劑和緩沖液
        4.1.4 儀器設備
    4.2 實驗方法
        4.2.1 HPLC法測木糖及木糖酸含量
        4.2.2 流式細胞儀檢測熒光蛋白表達量
        4.2.3 微流控細胞培養(yǎng)及檢測
        4.2.4 BL21（CstR-DE3）重組菌株的構(gòu)建
        4.2.5 細胞全蛋白的SDS-PAGE檢測
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 木糖酸生產(chǎn)的動態(tài)調(diào)控
        4.3.2 群體感應型基因回路用于蛋白表達純化
        4.3.3 BL21 （CstR-DE3）菌株的改造
        4.3.4 構(gòu)建并測試適配新菌株的質(zhì)粒表達載體
    4.4 本章小結(jié)
第五章 全文總結(jié)與展望
參考文獻
致謝
發(fā)表論文
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本文編號：3021727