細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)中,自誘導(dǎo)物通常并非常見(jiàn)的代謝中間產(chǎn)物,而是自身分泌的特定小分子物質(zhì)。硫化氫（H2S）作為微生物產(chǎn)生的一種內(nèi)源性小分子物質(zhì),具有自由跨膜的特性。大腸桿菌釋放的H2S主要由3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶（3-MST）途徑產(chǎn)生。以大腸桿菌為研究對(duì)象,我們發(fā)現(xiàn)作為第三類氣體信號(hào)分子的H2S與菌體密度線性相關(guān),而與大腸桿菌的種類、培養(yǎng)基類型以及培養(yǎng)基pH值無(wú)關(guān)。從動(dòng)態(tài)調(diào)控工程的角度,H2S符合群體感應(yīng)信號(hào)分子的特征,于是我們?cè)O(shè)計(jì)并構(gòu)建了基于H2S信號(hào)分子的群體感應(yīng)型基因回路。動(dòng)態(tài)調(diào)控基因回路涉及幾個(gè)關(guān)鍵元件:信號(hào)轉(zhuǎn)換器-信號(hào)感受器-啟動(dòng)器。硫醌氧化還原酶（SQR）是定位于質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的一種硫氧化蛋白,其功能是氧化H2S生成硫烷硫（HSnH,n>2）,相比于H2S的自由穿膜,生成的HSnH會(huì)保存于胞內(nèi),因此SQR可以充當(dāng)信號(hào)轉(zhuǎn)換器的角色,將胞外H2S信號(hào)轉(zhuǎn)換成胞內(nèi)HSnH信號(hào)。由于大腸桿菌自身并不含有SQR,故將PpSQR和CpSQR分別在大腸桿菌中異源表達(dá)并檢測(cè)其功能。結(jié)果顯示二者都可以在大腸桿菌中正常發(fā)揮作用,但酶活具有差異顯著。目前研究發(fā)現(xiàn)自然界存在多個(gè)能特異性感應(yīng)硫烷硫的轉(zhuǎn)錄... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號(hào)說(shuō)明
第一章 緒論
    1.1 引言
2S簡(jiǎn)介">    1.2 H₂S簡(jiǎn)介
2S的理化性質(zhì)及生理功能">        1.2.1 H₂S的理化性質(zhì)及生理功能
2S的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制">        1.2.2 H₂S的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制
2S在生物體內(nèi)的產(chǎn)生途徑">        1.2.3 H₂S在生物體內(nèi)的產(chǎn)生途徑
2S的生物氧化">        1.2.4 H₂S的生物氧化
2S的檢測(cè)">        1.2.5 H₂S的檢測(cè)
    1.3 硫烷硫簡(jiǎn)介
        1.3.1 硫烷硫的理化性質(zhì)及生理功能
        1.3.2 硫烷硫的產(chǎn)生
        1.3.3 硫烷硫的檢測(cè)
    1.4 硫氧化相關(guān)調(diào)控因子
        1.4.1 BigR
        1.4.2 CstR
        1.4.3 SqrR
        1.4.4 FisR
    1.5 群體感應(yīng)系統(tǒng)與動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控
        1.5.1 群體感應(yīng)
        1.5.2 動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控
    1.6 本論文的研究?jī)?nèi)容和意義
2S與菌體密度關(guān)系的研究">第二章 H₂S與菌體密度關(guān)系的研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 試劑和試劑盒
        2.1.3 儀器設(shè)備
        2.1.4 培養(yǎng)基和緩沖液
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        2.2.2 培養(yǎng)基pH的恒定
2S">        2.2.3 HPLC法檢測(cè)H₂S
        2.2.4 SSP4法檢測(cè)胞內(nèi)多硫化物
    2.3 結(jié)果與討論
2S釋放量與大腸桿菌菌體密度線性相關(guān)">        2.3.1 H₂S釋放量與大腸桿菌菌體密度線性相關(guān)
2S菌體密度相關(guān)性的影響">        2.3.2 不同遺傳背景的菌株對(duì)H₂S菌體密度相關(guān)性的影響
2S菌體密度相關(guān)性的影響">        2.3.3 不同培養(yǎng)基對(duì)H₂S菌體密度相關(guān)性的影響
2S菌體密度相關(guān)性的影響">        2.3.4 pH值對(duì)H₂S菌體密度相關(guān)性的影響
    2.4 本章小結(jié)
第三章 群體感應(yīng)型基因回路的構(gòu)建
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 本章所用引物
        3.1.3 試劑和試劑盒
        3.1.4 儀器設(shè)備
        3.1.5 培養(yǎng)基和緩沖液
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 E.coli TSB法感受態(tài)的制備（KCM法）
        3.2.2 E.coli電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備
        3.2.3 E.coli熱擊感受態(tài)的制備（化學(xué)感受態(tài)）
        3.2.4 多硫化物的制備及濃度檢測(cè)
        3.2.5 熒光報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建
        3.2.6 多硫化物的外源添加誘導(dǎo)
2O₂的外源添加誘導(dǎo)">        3.2.7 H₂O₂的外源添加誘導(dǎo)
        3.2.8 生長(zhǎng)周期及熒光值的酶標(biāo)儀檢測(cè)
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 信號(hào)轉(zhuǎn)換器的篩選
        3.3.2 信號(hào)感受器的篩選
        3.3.3 信號(hào)感受器與啟動(dòng)器的組裝
        3.3.4 完整基因回路的組裝與測(cè)試
        3.3.5 完整基因回路具有同步性和穩(wěn)定性
        3.3.6 遺傳背景、轉(zhuǎn)換器效率等因素對(duì)基因回路的影響
    3.4 本章小結(jié)
第四章 群體感應(yīng)型基因回路的應(yīng)用研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株和質(zhì)粒
        4.1.2 本章所用引物
        4.1.3 試劑和緩沖液
        4.1.4 儀器設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 HPLC法測(cè)木糖及木糖酸含量
        4.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光蛋白表達(dá)量
        4.2.3 微流控細(xì)胞培養(yǎng)及檢測(cè)
        4.2.4 BL21（CstR-DE3）重組菌株的構(gòu)建
        4.2.5 細(xì)胞全蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 木糖酸生產(chǎn)的動(dòng)態(tài)調(diào)控
        4.3.2 群體感應(yīng)型基因回路用于蛋白表達(dá)純化
        4.3.3 BL21 （CstR-DE3）菌株的改造
        4.3.4 構(gòu)建并測(cè)試適配新菌株的質(zhì)粒表達(dá)載體
    4.4 本章小結(jié)
第五章 全文總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
發(fā)表論文
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本文編號(hào)：3021727