本文關(guān)鍵詞：Gluconobacter thailandicus D-阿拉伯糖醇脫氫酶和木糖醇脫氫酶基因的克隆及協(xié)同表達(dá)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：木糖醇因其甜度高、熱量低且代謝不受胰島素影響等特性而備受關(guān)注,在食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,在國際市場上供不應(yīng)求。近年來,隨著綠色發(fā)展和可持續(xù)發(fā)展理念越來越深入人心,人們的環(huán)保意識增強(qiáng),生物法生產(chǎn)木糖醇逐漸成為各國學(xué)者開展研究的重點(diǎn)。D-阿拉伯糖醇脫氫酶(D-arabitol dehydrogenase,ArDH)和木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase,XDH)作為木糖醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶和限速酶,它們的高效表達(dá)對D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇起著至關(guān)重要的作用。因此,構(gòu)建高性能的基因工程菌,對于木糖醇生產(chǎn)效率的提高以及工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。本論文利用PCR技術(shù)從泰國葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter thailandicus)中擴(kuò)增出ArDH的編碼基因ardh,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-ardh,并在大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中得到了高效表達(dá);ardh的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析顯示有27kDa特異性蛋白條帶出現(xiàn),純化蛋白并測定其酶學(xué)性質(zhì)。當(dāng)以D-木酮糖為底物時,還原反應(yīng)的最適溫度為30℃,最適pH約為5.0,還原反應(yīng)的比活為11.46U/mg,對D-木酮糖的Km值為27mmol/L,Vmax為22.3μmol/min/mg;當(dāng)以D-阿拉伯糖醇為底物時,氧化反應(yīng)最適溫度為30℃,最適pH約為9.0,氧化反應(yīng)的比活為27.72U/mg,對D-阿拉伯糖醇的Km值為12.5mmol/L,Vmax為52.8μmol/min/mg。同時,克隆并表達(dá)了來自G.thailandicus的XDH的編碼基因xdh,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-xdh,并在大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)中得到了高效表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示重組菌BL21(DE3)-xdh有28kDa特異性蛋白條帶出現(xiàn)。經(jīng)過金屬鎳親和層析及Sephacryl S-300凝膠層析純化后,系統(tǒng)地測定其酶學(xué)性質(zhì)。當(dāng)以D-木酮糖為底物時,還原反應(yīng)的最適溫度為30℃,最適pH約為5.0,還原反應(yīng)的比活為126.3U/mg,對D-木酮糖的Km值為11.2mmol/L,Vmax為134.2μmol/min/mg;當(dāng)以木糖醇為底物時,氧化反應(yīng)最適溫度為35℃,最適pH約為11.0,氧化反應(yīng)的比活為28.6U/mg,對木糖醇的Km值為78.6mmol/L,Vmax為53.6μmol/min/mg。利用重組質(zhì)粒pET28a-xdh和pET28a-ardh構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-xdh-ardh,并轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3),實(shí)現(xiàn)了xdh和ardh基因的協(xié)同表達(dá)。對重組菌BL21(DE3)-xdh-ardh和原始菌G.thailandicus分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)果表明重組菌BL21(DE3)-xdh-ardh的木糖醇產(chǎn)量為23.7 g/L,原始菌G.thailandicus的木糖醇產(chǎn)量為12.9 g/L。重組菌從D-阿拉伯糖醇到木糖醇的轉(zhuǎn)化率為29.6%,相較于原始菌從D-阿拉伯糖醇到木糖醇的轉(zhuǎn)化率16.1%有較大提高。
【關(guān)鍵詞】：木糖醇 泰國葡萄糖酸桿菌 木糖醇脫氫酶 D-阿拉伯糖醇脫氫酶 協(xié)同表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：TS201.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 緒論12-25
• 1.1 木糖醇的概述12-13
• 1.2 化學(xué)加氫合成木糖醇13-14
• 1.3 生物轉(zhuǎn)化生成木糖醇14-21
• 1.3.1 以木糖為底物產(chǎn)木糖醇14-16
• 1.3.2 以葡萄糖為底物產(chǎn)木糖醇16-21
• 1.4 立題意義21-23
• 1.5 研究內(nèi)容23-24
• 1.6 技術(shù)路線24-25
• 第二章 ardh基因在E.coli中的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)測定25-45
• 2.1 引言25-26
• 2.2 材料26-28
• 2.2.1 菌株和質(zhì)粒26
• 2.2.2 主要酶和試劑26
• 2.2.3 培養(yǎng)基26-27
• 2.2.4 主要儀器設(shè)備27-28
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法28-37
• 2.3.1 菌體的培養(yǎng)和G. thailandicus總DNA的提取28-29
• 2.3.2 ArDH工程菌的構(gòu)建29-32
• 2.3.3 ArDH的誘導(dǎo)表達(dá)及純化32-34
• 2.3.4 ArDH酶學(xué)性質(zhì)研究34-37
• 2.4 結(jié)果與討論37-44
• 2.4.1 重組質(zhì)粒pET-28a-ardh的構(gòu)建37-38
• 2.4.2 ardh基因的序列分析38-39
• 2.4.3 重組酶的SDS-PAGE分析、純化及比活力測定39-41
• 2.4.4 ArDH的酶學(xué)性質(zhì)41-44
• 2.6 本章小結(jié)44-45
• 第三章 xdh基因在E.coli的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)測定45-59
• 3.1 引言45
• 3.2 材料45-46
• 3.2.1 菌株和質(zhì)粒45
• 3.2.2 主要酶和試劑45
• 3.2.3 培養(yǎng)基45
• 3.2.4 主要儀器設(shè)備45-46
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法46-51
• 3.3.1 菌體的培養(yǎng)和G. thailandicus總DNA的提取46
• 3.3.2 XDH工程菌的構(gòu)建46-48
• 3.3.3 XDH的誘導(dǎo)表達(dá)及純化48
• 3.3.4 XDH酶學(xué)性質(zhì)研究48-51
• 3.4 結(jié)果與討論51-58
• 3.4.1 重組質(zhì)粒pET-28a-xdh的構(gòu)建51-52
• 3.4.2 xdh基因的序列分析52-53
• 3.4.3 重組酶的SDS-PAGE分析、純化及比活力測定53-55
• 3.4.4 XDH的酶學(xué)性質(zhì)55-58
• 3.6 本章小結(jié)58-59
• 第四章 xdh和ardh基因在E.coli中的協(xié)同表達(dá)與D-阿拉伯糖醇的轉(zhuǎn)化59-67
• 4.1 引言59
• 4.2 材料59-60
• 4.2.1 菌株和質(zhì)粒59
• 4.2.2 主要酶和試劑59
• 4.2.3 培養(yǎng)基59-60
• 4.2.4 主要儀器設(shè)備60
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法60-63
• 4.3.1 菌體的培養(yǎng)和質(zhì)粒的提取60
• 4.3.2 分子克隆操作60-62
• 4.3.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)62
• 4.3.4 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇62-63
• 4.4 結(jié)果分析63-66
• 4.4.1 重組質(zhì)粒pET28a-xdh-ardh的構(gòu)建63-64
• 4.4.2 xdh和ardh基因協(xié)同表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析64-65
• 4.4.3 搖瓶發(fā)酵65-66
• 4.5 本章小結(jié)66-67
• 第五章 全文總結(jié)與展望67-70
• 5.1 主要結(jié)論67-68
• 5.2 展望68-70
• 參考文獻(xiàn)70-77
• 致謝77-78
• 在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他科研成果78

【相似文獻(xiàn)】

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7 楊_

本文編號：299858