體細(xì)胞核移植技術(shù)在家畜良種繁育、基因修飾動物生產(chǎn)、瀕危動物的拯救和人類疾病的治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值,但目前克隆動物生產(chǎn)效率較低,平均不超過5%。低下的克隆效率極大地限制了該技術(shù)的快速發(fā)展。在影響克隆豬生產(chǎn)效率的諸多因素中,X染色體的異常失活是導(dǎo)致克隆效率低下的重要原因,而與X染色體失活密切相關(guān)的一個重要基因是Xist基因,這表明Xist基因可能直接或間接地影響豬的克隆效率。本文以CRISPR/Cas系統(tǒng)為基礎(chǔ),在Xist基因上設(shè)計5個CRISPR/Cas系統(tǒng)打靶位點,并篩選出有效的Target 3、Target4 sg RNA,在細(xì)胞水平切割效率為1%和3%,在胚胎水平為75%和85.7%。同時將有效的sg RNA體外轉(zhuǎn)錄并顯微注射至胚胎體內(nèi),發(fā)現(xiàn)Target 3和Target 4組合效果最好,敲除效率為100%。通過胞漿注射和胚胎移植方法生產(chǎn)出6頭克隆豬,有2頭活仔實現(xiàn)完全敲除。本文成功建立Xist基因敲除豬模型,為后續(xù)通過敲除豬Xist基因提高克隆效率的研究奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：遺傳. 2016,38(12)北大核心

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

6-gRNA-N質(zhì)粒測序結(jié)果

第12期李國等:用CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立Xist基因豬模型1085圖2T7E1內(nèi)切酶檢測各靶位點對應(yīng)gRNA切割活性Fig.2Theindel(insertanddeletion)ofdifferentsgRNAsaftertreatedbyT7E1enzymeA～D分為Target2、Target3、Target4和Target5經(jīng)T7E1內(nèi)切酶酶切后的電泳結(jié)。1：突變體DNAPCR產(chǎn)物；2：野生型DNAPCR產(chǎn)物。M：500bpDNAMarker。圖3Target3、Target4靶位點測序結(jié)果Fig.3Target3,Target4targetsitesequencingresultsA：靶點突變類。圖中雙下劃線分為在Xist基因上設(shè)計的Target3、Target4靶點對應(yīng)的序列；紅色橫線示堿基缺；紅色示堿基揑。B：U6-gRNA-3和U6-gRNA-4轉(zhuǎn)染8號單隆測序結(jié)；C：U6-gRNA-3和U6-gRNA-4轉(zhuǎn)染11號單隆測序結(jié)。雙下劃線示在Xist基因上設(shè)計的Target3、Target4靶點對應(yīng)sgRNA序列。

第12期李國等:用CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立Xist基因豬模型1085圖2T7E1內(nèi)切酶檢測各靶位點對應(yīng)gRNA切割活性Fig.2Theindel(insertanddeletion)ofdifferentsgRNAsaftertreatedbyT7E1enzymeA～D分為Target2、Target3、Target4和Target5經(jīng)T7E1內(nèi)切酶酶切后的電泳結(jié)。1：突變體DNAPCR產(chǎn)物；2：野生型DNAPCR產(chǎn)物。M：500bpDNAMarker。圖3Target3、Target4靶位點測序結(jié)果Fig.3Target3,Target4targetsitesequencingresultsA：靶點突變類。圖中雙下劃線分為在Xist基因上設(shè)計的Target3、Target4靶點對應(yīng)的序列；紅色橫線示堿基缺；紅色示堿基揑。B：U6-gRNA-3和U6-gRNA-4轉(zhuǎn)染8號單隆測序結(jié)；C：U6-gRNA-3和U6-gRNA-4轉(zhuǎn)染11號單隆測序結(jié)。雙下劃線示在Xist基因上設(shè)計的Target3、Target4靶點對應(yīng)sgRNA序列。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9的應(yīng)用及脫靶效應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 鄭武,谷峰.  遺傳. 2015(10)
[2]CRISPR/Cas系統(tǒng):RNA靶向的基因組定向編輯新技術(shù)[J]. 李君,張毅,陳坤玲,單奇?zhèn)?王延鵬,梁振,高彩霞.  遺傳. 2013(11)
[3]初次卵裂時間是豬克隆胚胎發(fā)育潛能的重要標(biāo)識[J]. 羅學(xué)明,肖煒,馮沖,龍川,閆軍,薛振華,云鵬,潘登科.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2010(12)

博士論文
[1]小鼠2-細(xì)胞胚胎姐妹卵裂球基因差異表達(dá)研究[D]. 孫健紅.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2012



本文編號：2991361