盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一個強大的、不可思議的基因組編輯工具,但人們在實際應(yīng)用中還是發(fā)現(xiàn)其并不是沒有缺陷。對于PAM-free和CRISPR受限制的區(qū)域,當下通常使用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)都不能有效的編輯,而其較高的脫靶幾率則使其不能得到更廣泛的應(yīng)用。為了改進這些缺陷,我們開發(fā)了一個非常簡單的基于CRISPR/cas9的無質(zhì)粒一步法（CAGO）基因組編輯技術(shù),它不需要構(gòu)建一個來表達特定的gRNA的質(zhì)粒。而是通過構(gòu)建一個具有極高靶向效率的通用N20序列,以同源重組的方式插入到大腸桿菌的染色體中,然后誘導CRISPR/Cas9在通用N20序列處切割雙鏈DNA造成染色體雙鏈斷裂,再誘導染色體重組修復(fù)以完成編輯過程。實驗已證明這一技術(shù)能夠沒有任何副作用的編輯CRISPR受限制的DNA區(qū)域。當應(yīng)用到多位點編輯時,CAGO可以在兩天內(nèi)以幾乎100%的編輯效率編輯一個靶目標。此外,稍微調(diào)整后的CAGO能夠用于編輯多達100kbp的大片段區(qū)域,編輯效率達到75%。最后,在CAGO的基因組編輯方法構(gòu)建中,通過應(yīng)用模塊化的設(shè)計策略,進一步簡化了供體DNA線性片段的轉(zhuǎn)換過程和構(gòu)建。雖然該技術(shù)是... 

【文章來源】：西華師范大學四川省

【文章頁數(shù)】：54 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

PAM-free示意圖

圖 2-1 part A 和線性目標載體的 Golden Gate 裝配Fig. 2-1 Golden Gate assembly of partA with a linearized destination v

CAGO編輯片段的構(gòu)建Figure2-2.ConstructionofeditfragmentsofCAGO.

【參考文獻】：
期刊論文
[1]2017合成生物學�？蜓訹J]. 張先恩.  生物工程學報. 2017(03)
[2]合成生物學技術(shù)的研究進展——DNA合成、組裝與基因組編輯[J]. 李詩淵,趙國屏,王金.  生物工程學報. 2017(03)
[3]天然產(chǎn)物合成生物學關(guān)鍵技術(shù)[J]. 匡雪君,鄒麗秋,李瀅,孫超,陳士林.  中國中藥雜志. 2016(22)
[4]人工核酸內(nèi)切酶介導的新一代基因組編輯技術(shù)進展[J]. 肖安,張博.  生物工程學報. 2015(06)
[5]基因組編輯[J]. 克里斯蒂娜·拉爾森,威阿曼達·謝弗.  科技創(chuàng)業(yè). 2014(05)
[6]TALENs:一種新的基因定點修飾技術(shù)[J]. 張金脈,任兆瑞.  生命科學. 2013(01)
[7]曲霉菌細胞工廠的現(xiàn)狀及前景[J]. 顧豐穎,高潔,何國慶.  食品工業(yè)科技. 2012(23)
[8]制備高效大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞和電轉(zhuǎn)化條件的研究[J]. 朱森康,黃磊,李燕飛,鐘衛(wèi)鴻,徐志南.  生物技術(shù)通報. 2011(10)
[9]應(yīng)用基因組工程構(gòu)建新型大腸桿菌細胞工廠[J]. 蔡釩,方宏清,陳必鏈.  生命科學. 2011(09)
[10]生物煉制細胞工廠:生物制造的技術(shù)核心[J]. 馬延和.  生物工程學報. 2010(10)

博士論文
[1]植物合成生物學工具箱的優(yōu)化及其在基因組編輯中的應(yīng)用研究[D]. 張海艷.中國農(nóng)業(yè)大學 2017

碩士論文
[1]基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的谷氨酸棒狀桿菌基因組編輯技術(shù)的研究[D]. 靳海迎.山東大學 2017
[2]CRISPR/Cas9與ZFNs 介導牛MSTN位點基因打靶效率的比較研究[D]. 劉慧.內(nèi)蒙古大學 2015
[3]代謝網(wǎng)絡(luò)端通路計算方法的研究[D]. 王英.復(fù)旦大學 2012
[4]抑癌基因PTEN在同源重組修復(fù)及其敲除對Rad51基因表達的影響及機制研究[D]. 莫琳.重慶醫(yī)科大學 2009



本文編號：2989359