單一轉(zhuǎn)蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis, Bt）基因Cry1Ab/Cry1Ac抗蟲棉（Gossypium）作為我國生產(chǎn)上大面積種植作物,隨著種植時間及面積的增加導(dǎo)致害蟲對Bt毒蛋白的抗性增強(qiáng)迫使新型Bt基因研究工作成為解決問題的關(guān)鍵。Cry5Aa是一種具有兼抗鱗翅目和線蟲的新型Bt殺蟲基因,由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花研究所成功轉(zhuǎn)入棉花,并獲得穩(wěn)定遺傳的’JX0010’、’JX0020’品系,本研究構(gòu)建了Cry5Aa全長基因原核表達(dá)載體,優(yōu)化了原核表達(dá)誘導(dǎo)條件,并且對其在轉(zhuǎn)Bt-Cry5Aa基因棉花品系中的表達(dá)進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明,在37℃220 r/min 1.0 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside, IPTG）條件下誘導(dǎo)4 h,其蛋白表達(dá)量最高。通過Western blot分析,發(fā)現(xiàn)蛋白分子量為79 kD,與理論值一致;同時,該蛋白以包涵體形式存在,通過谷胱甘肽-Sepharose4B小顆粒親和層析純化,蛋白純度可達(dá)95%以上;轉(zhuǎn)Bt-Cry5Aa基因棉花品系的鑒定實(shí)驗(yàn)表明:Cry5... 

【文章來源】：農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2020,28(09)北大核心

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

Bt-Cry5Aa質(zhì)粒圖譜

不同時間1.0 mmol/L IPTG濃度誘導(dǎo)、表達(dá)

采用帶有限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、SaIⅠ酶切位點(diǎn)的引物，Bam HⅠ、SaIⅠ酶切消化、回收pGEX-4T-3載體和Cry5Aa目的基因片段，把pGEX-4T-3表達(dá)載體和Cry5Aa目的片段相連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)。進(jìn)行初步PCR陽性克隆質(zhì)粒(圖3)鑒定在LB固體平板(含Amp)上挑取的過夜培養(yǎng)的6個單菌落。然后擴(kuò)培初步鑒定的3個陽性質(zhì)粒菌液，提取得到質(zhì)粒；進(jìn)一步鑒定陽性重組載體采用Bam HⅠ、SaIⅠ雙酶切。有3個陽性重組載體酶切(圖4)在瓊脂糖凝膠電泳顯示后，在5 000和2 000 bp處出現(xiàn)特異性片段，其中在5 000 bp處出現(xiàn)的特異性片段與pGEX-4T-3 (4968 bp)空載體相接近，在2 000 bp處出現(xiàn)的特異性片段則與Cry5Aa目的基因片段(2097 bp)相接近，表明pGEX-4T-3+Cry5Aa (+)表達(dá)載體的構(gòu)建成功，而且經(jīng)過測序后此結(jié)果得到了進(jìn)一步確認(rèn)。圖3 重組pGEX-4T-3+Cry5Aa (+)質(zhì)粒初步PCR鑒定

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]轉(zhuǎn)cry1Ab+cry1C雙價抗蟲水稻對二化螟的抗性評價[J]. 陳耕,何珊,韓蘭芝,彭于發(fā).  中國生物防治學(xué)報(bào). 2018(01)
[2]二化螟Cry1Ac汰選品系對不同Bt蛋白的敏感性[J]. 何珊,徐楊洋,韓蘭芝,賈變桃,彭于發(fā).  植物保護(hù)學(xué)報(bào). 2017(03)
[3]鹽堿土壤轉(zhuǎn)Bt基因棉花外源蛋白表達(dá)量時空變化及對抗蟲性的影響[J]. 雒珺瑜,崔金杰,張帥,朱香鎮(zhèn),呂麗敏,王春義,張利娟,王麗,李春花,周治國.  生態(tài)學(xué)報(bào). 2017(16)
[4]棉鈴蟲對轉(zhuǎn)Bt基因棉花的行為反應(yīng)[J]. 趙冬曉,劉標(biāo).  環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào). 2017(01)
[5]Bt殺蟲基因研究現(xiàn)狀與趨勢[J]. 束長龍,張風(fēng)嬌,黃穎,李艷秋,張杰.  中國科學(xué):生命科學(xué). 2016(05)
[6]中國轉(zhuǎn)基因棉花研發(fā)應(yīng)用二十年[J]. 郭三堆,王遠(yuǎn),孫國清,金石橋,周燾,孟志剛,張銳.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2015(17)
[7]轉(zhuǎn)Bt基因棉花殺蟲蛋白表達(dá)規(guī)律及對棉鈴蟲控制作用研究[J]. 徐麗娜,胡本進(jìn),李路,周子燕,胡飛,李昌春.  安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2015(05)
[8]基于高分辨熔解分析的cry1I類基因的克隆、表達(dá)及活性分析[J]. 趙燦,張春鴿,束長龍,孫冰,宋福平,高繼國,張杰.  中國生物防治學(xué)報(bào). 2013(01)
[9]棉花葉片蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)的優(yōu)化[J]. 郭忠軍,陳全家,許春華,王希東,蘇秀娟,曲延英.  棉花學(xué)報(bào). 2012(05)
[10]蘇云金芽孢桿菌cry1基因的克隆、植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化大豆[J]. 馮頔,張莉弘,魏毅,劉金亮,潘洪玉,張世宏.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2011(07)

博士論文
[1]轉(zhuǎn)Bt抗蟲棉對非靶標(biāo)昆蟲的安全性評價[D]. 牛林.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017



本文編號：2988034