用途廣泛的對(duì)羥基苯甲酸（4HBA）,是一種有機(jī)合成原料,普遍應(yīng)用于食品、化妝品、液晶制品、殺菌劑等領(lǐng)域。從石油成分中化學(xué)合成會(huì)帶來環(huán)境污染問題;利用植物中合成的4HBA會(huì)被酯化;利用重組大腸桿菌合成4HBA有產(chǎn)量問題。本實(shí)驗(yàn)室從海洋環(huán)境中收集分離出20多株Microbulbifer屬的菌株,發(fā)現(xiàn)它們都合成積累4HBA和4HBA酯類等次級(jí)代謝產(chǎn)物,其中A4B-17菌株的合成量最多。我們已經(jīng)完成了A4B-17菌株的基因組測(cè)序和注釋等工作,通過對(duì)該菌株的深入研究一方面可以克服以前生產(chǎn)方式的弊端,另一方面可以從可再生資源合成4HBA等工業(yè)原料。本研究針對(duì)A4B-17菌株合成對(duì)羥基苯甲酸途徑中的一個(gè)反應(yīng)做了深入研究。該反應(yīng)是磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和4-磷酸赤蘚糖（E4P）的縮合反應(yīng),在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（DHAP）合酶的作用下生成DHAP。A4B-17菌株的基因組上有三個(gè)基因編碼DHAP合酶,基因編號(hào)分別為GM002069、GM001679、GM001835。本研究對(duì)這三個(gè)基因在大腸桿菌中高效表達(dá)后,進(jìn)行了酶的性質(zhì)研究。采用pCold IV載體對(duì)基因進(jìn)行表達(dá),檢測(cè)方法為高效... 

【文章來源】：江蘇師范大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：120 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 選題依據(jù)
    1.2 對(duì)羥基苯甲酸的合成現(xiàn)狀
    1.3 微泡菌Microbulbifersp.A4B?17菌株
    1.4 DAHP合酶
    1.5 蛋白的表達(dá)與純化
    1.6 研究?jī)?nèi)容及意義
    1.7 基因分析
第二章 DAHP合酶基因GM002069的克隆與表達(dá)
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.1.1 使用菌株
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 質(zhì)粒提取試劑
        2.1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑
        2.1.6 其他試劑
        2.1.7 PCR反應(yīng)體系與條件
        2.1.8 核酸瓊脂糖凝膠電泳
        2.1.9 質(zhì)粒的提取
        2.1.10 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.1.11 質(zhì)粒載體的酶切體系
        2.1.12 粗酶的提取
        2.1.13 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
        2.1.14 層析
    2.2 表達(dá)質(zhì)粒pColdI-GM002069結(jié)果
        2.2.1 目的基因的克隆
        2.2.2 基因表達(dá)
        2.2.3 蛋白定量
        2.2.4 蛋白純化
        2.2.5 硫代巴比妥酸法酶活測(cè)定
    2.3 表達(dá)質(zhì)粒pColdIV-GM002069結(jié)果與討論
        2.3.1 目的基因的克隆
        2.3.2 基因表達(dá)
        2.3.3 高效液相色譜法I酶活驗(yàn)證
        2.3.4 不同條件下的酶活曲線
    2.4 表達(dá)質(zhì)粒pET-21a（+）-GM002069結(jié)果與討論
        2.4.1 目的基因的克隆
        2.4.2 基因表達(dá)
        2.4.3 高效液相色譜法II酶活驗(yàn)證
        2.4.4 反饋調(diào)控
        2.4.5 本章小結(jié)
第三章 DAHP合酶基因GM001679的克隆與表達(dá)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        3.1.1 使用菌株
        3.1.2 主要儀器設(shè)備
        3.1.3 PCR反應(yīng)體系與條件
        3.1.4 質(zhì)粒的提取
        3.1.5 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
        3.1.6 蛋白含量測(cè)定
        3.1.7 DAHP合酶活性測(cè)定
        3.1.8 高效液相色譜的使用
    3.2 表達(dá)質(zhì)粒pColdI-GM001679結(jié)果與討論
        3.2.1 目的基因的克隆
        3.2.2 基因表達(dá)
        3.2.3 蛋白定量
        3.2.4 硫代巴比妥酸法酶活測(cè)定
    3.3 表達(dá)質(zhì)粒pColdIV-GM001679結(jié)果與討論
        3.3.1 目的基因的克隆
        3.3.2 基因表達(dá)
        3.3.3 高效液相色譜法I酶活測(cè)定
        3.3.4 不同條件下的酶活曲線
        3.3.5 反饋調(diào)控
    3.4 表達(dá)質(zhì)粒pET-21a（+）-GM001679結(jié)果與討論
        3.4.1 目的基因的克隆
        3.4.2 基因表達(dá)
        3.4.3 酶活驗(yàn)證
        3.4.4 反饋調(diào)控
        3.4.5 本章小結(jié)
第四章 GM001835基因DAHP合酶的克隆與表達(dá)
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        4.1.1 使用菌株
        4.1.2 主要儀器設(shè)備
        4.1.3 使用試劑
        4.1.4 PCR反應(yīng)體系與條件
        4.1.5 核酸瓊脂糖凝膠電泳
        4.1.6 質(zhì)粒的提取注意事項(xiàng)
        4.1.7 質(zhì)粒載體的酶切體系
        4.1.8 粗酶的提取
        4.1.9 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
    4.2 表達(dá)載體pColdIV-GM001835結(jié)果與討論
        4.2.1 目的基因的克隆
        4.2.2 基因表達(dá)
        4.2.3 高效液相色譜法酶活測(cè)定
        4.2.4 不同條件下的酶活曲線
        4.2.5 反饋調(diào)控
總結(jié)與展望
附錄
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷
學(xué)位論文數(shù)據(jù)集



本文編號(hào)：2985971