目的:利用pGC-SPAG6-shRNA重組慢病毒載體在MDS細胞中靶向沉默SPAG6基因,明確SPAG6表達差異與PTEN的關(guān)系,從體內(nèi)體外兩方面探究SPAG6是否通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控骨髓增生異常綜合征（MDS）細胞凋亡,為MDS治療探索新的靶點。方法:1.構(gòu)建SPAG6-/-型SKM-1細胞模型:利用SPAG6-shRNA及NC-shRNA重組慢病毒載體,轉(zhuǎn)染人MDS細胞株SKM-1細胞,流式細胞術(shù)檢測病毒轉(zhuǎn)染效率,熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達,qRT-PCR檢測mRNA表達水平,Western blot檢測蛋白表達水平。2.探討SPAG6在MDS細胞中對PTEN/PI3K/AKT信號通路活化的影響。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡,Western blot檢測PTEN/PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達。隨后,利用PI3K/AKT抑制劑（Ly294002）和Caspase抑制劑（z-VAD-fmk）作用轉(zhuǎn)染慢病毒的SKM-1細胞,Western blot檢測PI3K/AKT通路相關(guān)凋亡蛋白表達。3.探索SPAG6在體內(nèi)對MDS細胞凋亡的影響及機制:構(gòu)建MDS荷瘤小鼠模型,檢測小鼠... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２：干擾ＳＰＡＧ６表達后，細胞凋亡增加??－

中的ｃａｓｐａｓｅ－８表達無明顯變化，無統(tǒng)計學(xué)差異（ｐ＞０．０５），說明ｃａｓｐａｓｅ成功被抑??制。此時檢測ＰＴＥＮ的表達，發(fā)現(xiàn)ＰＴＥＮ的活化并不受影響，同時凋亡通路中??ｃａｓｐａｓｅ－９及ｃａｓｐａｓｅ－３的表達增加（ｐ＜０．０５，圖６Ａ和Ｂ）。由此說明干擾ＳＰＡＧ６??表達后

直至組織完全裂解。提取組織蛋白，進行相關(guān)蛋白檢測。結(jié)果顯示，干擾組中ＰＴＥＮ??蛋白表達增加，ＡＫＴ和Ｂｃｌ－２表達下降，細胞色素ｃ表達增加，與體外結(jié)果一致??（圖８）。表明ＳＰＡＧ６在體內(nèi)可通過ＰＴＥＮ調(diào)控細胞內(nèi)源通路誘導(dǎo)細胞凋亡。??Ａ??３?ｂ??＾?□?ＮＣ－ｓｈＲＮＡ??＾?＾－?ＳＰＡＧ６（５０ｋＤａ）?｜?２?°１?■?ＳＰＡＧ６－ｓ＿Ａ??＿?＿—?ｌ?＾??？?－?ｍｍｍ?ＰＴＥＮ（５５ｋＤａ）?Ｉ?１５＇??｜?ＡＫＴ（６０ｋＤａ）?｜?ｉ?Ｊ?料??．?Ｂｃｌ－２（２２ｋＤａ）?０．５－?Ｉ?ｒ＾ｌ?■??—ｊ?ＣｙｔｏＣ（１５ｋＤａ）?ｇ?，，０．１ＬＰ－ＬＰ?１?Ｐ?Ｉ?｜ｌ?Ｉ?Ｐ??ＧＡＰＤＨ（３６ｋＤａ）??圖８：干擾ＳＰＡＧ６表達后組織相關(guān)凋亡蛋白的表達??Ｆｉｇｕｒｅ?８：?Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ?ｏｆ?ＳＰＡＧ６?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｒｅｌａｔｉｖｅ?ａｐｏｐｔｏｓｉｓ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｏｆ?ｔｕｍｏｒ?ｃｅｌｌｓ??（Ａ）?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｆｏｒ?ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ＳＰＡＧ６，?ＰＴＥＮ，?ＡＫＴ，?ＢＣＬ－２，?ａｎｄ?ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ??ｃ?ｉｎ?ｔｕｍｏｒ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ｆｒｏｍ?ｍｉｃｅ?ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ?ｗｉｔｈ?ＳＫＭ－１?ｃｅｌｌｓ?ｔｈａｔ?ｗｅｒｅ?ｐｒｅ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｗｉｔｈ??ＳＰＡＧ６－ｔａｇｅｔｉｎｇ?ｓｈＲＮＡ?ｏｒ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｓｈＲＮＡ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ．?ＧＡＰＤＨ?ｗａｓ?ｕｓｅｄ?ａｓ?ａ?ｌｏａｄｉｎｇ?ｃｏｎｔｒｏｌ．??Ｌａｎｅ?ａ

【參考文獻】：
期刊論文
[1]A Zebrafish Model of 5q-Syndrome Using CRISPR/Cas9 Targeting RPS14 Reveals a p53-Independent and p53-Dependent Mechanism of Erythroid Failure[J]. Jason Ear,Jessica Hsueh,Melinda Nguyen,QingHua Zhang,Victoria Sung,Rajesh Chopra,Kathleen M.Sakamoto,Shuo Lin.  Journal of Genetics and Genomics. 2016(05)



本文編號：2980900