研究背景和目的低氧環(huán)境是地球上生物面臨的極端環(huán)境之一,包括高緯度低氧環(huán)境如中國的青藏高原,地下以及洞穴低氧環(huán)境,和水生哺乳動物面臨的周期性低氧環(huán)境等。長期低氧會導致機體在生理和病理上產(chǎn)生一系列不良反應,嚴重時還會導致許多疾病發(fā)生,如肺纖維化,哮喘,心腦血管疾病等。而在人體的所有器官中大腦的神經(jīng)元對低氧的耐受性是最低的,因為腦組織的能量幾乎全部都來自于有氧代謝,幾乎沒有無氧代謝。近些年來,CRISPR/Cas9基因編輯技術因為其易操作,效率高已廣泛地應用在多個生物科學領域,并且它作為一種高通量研究基因功能的工具使得從全基因組層面上研究基因對特定細胞表型的貢獻成為可能。所以在這一背景下,我們想通過CRISPR/Cas9全基因組文庫篩選技術在神經(jīng)細胞中找到一些新的低氧耐受基因。研究方法和結論本研究首先在小鼠神經(jīng)瘤母細胞細胞系N2a上優(yōu)化了小鼠全基因組敲除文庫的慢病毒文庫感染體系,然后構建了包含全基因組文庫的穩(wěn)轉細胞株,將其低氧處理后收集活細胞進行富集,通過優(yōu)化測序建庫方法后將富集的細胞進行二代測序,在得到數(shù)據(jù)后利用生物信息學分析樣本之間的相關性,后進行樣本中基因數(shù)和sgRNA數(shù)目的認證,接下... 

【文章來源】：蘇州大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－１．實驗流程圖

）；??磁珠法動物組織基因組ＤＮＡ提取試劑盒（ＤＰ３４１－０２，天根，中國）；??２．２．２實驗方法??１．?ＧｅＣＫＯｖ２ｓｇＲＮＡ文庫準備：最初的文庫由焦保衛(wèi)教授實驗室提供，后面??根據(jù)焦保衛(wèi)老師實驗室提供的擴大文庫的步驟進行我們自己文庫的擴大培養(yǎng)［３０］。??Ｓｉｎｇｌｅ－ｖｅｃｔｏｒ?ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ?ＧｅＣＫＯ?ｓｙｓｔｅｍ??ｃＰＰＴ??ｐｓｉ＋?ＲＲＥ?Ｕ６?ｓｇＲＮＡ?ＥＦＳ?ＳｐＣａｓ９?Ｆｌａｇ?Ｐ２ＡＰｕｒｏ?ＷＰＲＥ??ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２??圖２－２．優(yōu)化后的病毒載體丨２９丨。??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２．?Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ?ｖｉｒｕｓ?ｖｅｃｔｏｒ．??具體步驟如下：??９??

下整個篩選實驗的流程：在拿到小鼠ＣＲＩＳＰＲ全基因組敲除文庫??之后，進行文庫的擴大培養(yǎng)之后用來感染目的細胞系（小鼠神經(jīng)瘤母細胞），在經(jīng)??過多次實驗摸索之后確定感染條件保證絕大部分細胞每個細胞只感染一條??ｓｇＲＮＡ，構建好目的細胞系的穩(wěn)轉細胞株后，放在１％的低氧環(huán)境下分別處理７２??小時和９６小時，不適應這種環(huán)境的細胞就會死掉，而活下來的細胞里面可能就存??在較為感興趣的基因。再將這些細胞富集到一定數(shù)量時，提取其基因組ＤＮＡ，擴??增出ｓｇＲＮＡ片段之后送去測序，后進行數(shù)據(jù)分析。圖２－３為整個實驗設計的流程??圖［３１］：??Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：?Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：??—７Ｔ＼?ｆ￣ｒ＼—＾?ｒ＊ｖ?Ｉ?ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ?ｏｆ?ｃｌｏｎｅｓ?ｌｏｓｓ?ｏｆ?ｅｓｓｅｎｔｉａｌ?ｇｅｎｅｓ??圓？國？國？圍??ｌ．Ｏｌｉｇｏ?２．Ｐｌａｓｍｉｄ?３．Ｖｉｒｕｓ?々．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ?＼＿ｙ??ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐｏｏｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ?Ｓ．Ｃｏｎｄｕｃｔ?ａ?ｓｃｒｅｅｎ?ｗｉｔｈ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ??ｔｏ?ｃｅｌｌｓ?ｏｒ?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ??ｓｇＲＮＡ?丨ｎｉｔ．?Ｐｏｓ．?Ｎｅｇ．???????１６?０?０?？？？？？？？？?Ｎ?？?￣￣??￣＾￣＾￣ｇＤＮＡ－ｖｅｃｔｏｒ－ｓｇＲＮＡ－ｖｅｃｔｏｒ－ｇＤＮＡ??—１７?〇—＾—??丨?■?■—?７．Ｎｅｘｔ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?６．ＰＣＲ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ??８．Ｍａｔｒｉｘ?ｏｆ?ｓｇＲ

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：2979767