隨著全球環(huán)境的不斷惡化以及石油能源的日漸枯竭,生物航空燃料因其碳排放量少、可循環(huán)再生等特點(diǎn)受到越來越多的關(guān)注。本研究以純系蓖麻為實(shí)驗(yàn)材料,通過構(gòu)建穩(wěn)定的純系蓖麻轉(zhuǎn)基因離體再生體系,采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除蓖麻RcFAH12基因,培育功能缺失突變體。期待獲得低羥基蓖麻油酸新品種,使蓖麻基生物航油在工業(yè)制備過程中省略脫氧工藝,進(jìn)而大幅度降低航油制備成本,符合航空產(chǎn)業(yè)需求,提高市場應(yīng)用價(jià)值。本文成功克隆了蓖麻RcFAH12基因序列,應(yīng)用數(shù)據(jù)庫及生物信息學(xué)計(jì)算分析結(jié)果,預(yù)測蓖麻油酰12-羥化酶的理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)及互作網(wǎng)絡(luò)等重要生物學(xué)特性,并對基因數(shù)據(jù)公布序列及五種純系蓖麻的RcFAH12基因的測序結(jié)果進(jìn)行比對分析。數(shù)據(jù)分析顯示,RcFAH12基因與FAD2、DGAT等多個(gè)脂肪酸合成通路中重要的蛋白互作相關(guān),強(qiáng)烈暗示蓖麻RcFAH12基因序列的敲除將引起蓖麻油脂肪酸組分的改變;序列比對結(jié)果表明,RcFAH12基因具有高度保守性,為CRISPR/Cas9基因敲除載體特異性識別、剪切提供保證。在實(shí)驗(yàn)室已有研究成果的基礎(chǔ)上對10種純系蓖麻品種進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示,HP003、HP00... 

【文章來源】： 侯宇奇 天津科技大學(xué)

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－２蓖麻酸甘油酯分子結(jié)構(gòu)式??

后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。??通過電泳檢測及測序比對篩選正確克隆的大腸桿菌菌斑，搖菌抽提重組的終載??體，質(zhì)粒提取的操作方法同２．２．８。提取的質(zhì)粒放置于－２０°Ｃ保存?zhèn)溆谩??２．７．５?口四８４０１－故‘／＾／／／２－�。常。�?載體的構(gòu)建??該載體的構(gòu)建使用ＴＩＡＮＧＥＮ公司生產(chǎn)的ＥａｓｙＧｅｎｏ?Ａｓｓｅｍｂｌｙ?Ｃｌｏｎｉｎｇ?ｋｉｔ。反應(yīng)需??要同時(shí)擴(kuò)增依次具有３０ｂｐ左右重疊序列的目的片段，通過快速同源重組將目的靶點(diǎn)??的核苷酸序列整合至載體骨架。反應(yīng)原理及載體模式圖如圖２－２。??Ａ?—＿?＿?Ｂ??Ｍ?ｍ?ｇＲＮＡ?Ｃａｓ９?Ｎｏｓｔｅｒ??一?ＡＩＵ６?＼?＼?＼?Ｈｙｇ??－－?ｘ?Ｔａｒｇｅｔ?＼?３５ｓ?＼ＮＬＳ?＼?ＮＬＳ?＼?３５Ｓ?／??—?Ｉ?Ｉ?—??＇ｖ?Ｖｅｔｌｏｒ?夕??圖２－２載體模式圖??Ｆｉｇ．?２－２?Ｖｅｃｔｏｒ?ｐａｔｔｅｒｎ??Ａ：同源重組酶原理示意圖；Ｂ：?ｐＫ￡Ｓ４０１載體示意圖??Ａ：?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ；?Ｂ：?ｐＫＪＥＳ４０１?ｖｅｃｔｏｒ?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ??２．７．５．１目的條帶的擴(kuò)増??以ｐＫＥＳ４０ｌ質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。所用擴(kuò)增引物及目的片段大小如表??２－所示，。使用ＫＡＰＡ公司的ＫＡＰＡ熱啟動(dòng)ＨｉＦｉ高保真酶ＲｅａｄｙＭｉｘ進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，??反應(yīng)體系如表２－所示，延伸時(shí)間縮短至４５ｓｅｃ，其余ＰＣＲ反應(yīng)程序如表２－２８所示。??反應(yīng)結(jié)束后，取２．５?Ｌ的ＰＣＲ產(chǎn)物混合０．５?Ｌ的６ＸＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ進(jìn)

?２材料與方法???ＧｍＵ６?Ｐｒｏｍｏｔｅｒ?１９ｂｐ?Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ?Ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ｇＲＮＡ??ＧＴＴＴＡＴＡＴＡＧ?ＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡ?ＡＧＧＡＡ丨?義丨ＳＨ?ＮＮＮＮＮＮＭＮＭＭＮＮＮＭＮＮＮＮＮ?ＧＨＩＴＡＧＡＧＣ?ＩＡＧＡＡＡＴＡ６Ｃ?ＡＡＧＴＴＡＡＡＡＩ??ＣＡＡＡＴＡＴＡＴＣ?ＧＴＧＧＡＣＣＴＣＴ?ＴＣＣＴＴＡＣ?ＣＡ?Ａ?ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＷＮＮ?ＡＴＣＴＣＧ?ＡＴＣＴＴＴＡＴＣＧ?ＴＴＣＡＡＴＴＴＴＡ??圖２－３載體模式圖??Ｆｉｇ．?２－３?Ｖｅｃｔｏｒ?ｐａｔｔｅｒｎ??２．７．７農(nóng)桿菌侵染工程菌株的制備??使用委托杭州百格生物技術(shù)有限公司構(gòu)建的ｐＢＧＫ０４１－／？ｃＥ４／／７２－Ｔ３基因敲除載體??和自我構(gòu)建的?ｐＣＡＭＢＩＡ?１３００－ＲｃＦＡＨ１２－Ｔ３／Ｔ５?及?ｐＫＥＳ４０Ｗ化抑＂７２－丁３／�。�?基因敲除??載體，轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌ＬＢＡ４４０４．實(shí)驗(yàn)方法如２．３．１。挑選菌斑形態(tài)良好的菌斑進(jìn)行菌斑??ＰＣＲ檢測，操作同２．２．７。鑒定陽性菌斑后挑斑至含有相應(yīng)抗生素的ＬＢ液體培養(yǎng)基中，??２８°Ｃ過夜振蕩培養(yǎng)。最后保菌并放置于－８０°Ｃ備用，處理辦法如２．２．８所述。??２．８低羥基轉(zhuǎn)基因蓖麻的培育??按照２．５中優(yōu)化的蓖麻遺傳轉(zhuǎn)化體系繼續(xù)培育蓖麻新品種，使用２．７．７制備的三種??農(nóng)桿菌侵染工程菌株侵染蓖麻外植體，期待獲得具有低羥基轉(zhuǎn)基因蓖麻表型的蓖麻油??酰１２－羥化酶功能缺失型突變體，為基因編輯技術(shù)在蓖麻領(lǐng)域的應(yīng)用以及蓖麻分子育??種方向帶來新的成果。??３６??


本文編號：2969943