目的:利用目前高效快捷的CRISPR技術(shù)對(duì)體外培養(yǎng)的人原代淋巴細(xì)胞進(jìn)行PD-1和CTLA-4基因雙敲除方法:一.通過針對(duì)CTLA-4基因和PD-1基因各設(shè)計(jì)了三組候選sgRNA序列,并據(jù)此構(gòu)建CRISPR-CTLA-4和CRISPR-PD-1敲除質(zhì)粒。使用293淋巴細(xì)胞系驗(yàn)證了各個(gè)sgRNA的編輯效率。將對(duì)CTLA-4和PD-1基因編輯最高的兩個(gè)sgRNA構(gòu)建CRISPR-CTLA-4-PD-1雙敲除質(zhì)粒。二.使用電穿孔的方法,嘗試將CRISPR-CTLA-4-PD-1雙敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人原代淋巴細(xì)胞中。為了達(dá)到電穿孔轉(zhuǎn)染原代淋巴細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn),對(duì)電穿孔的各種條件進(jìn)行了摸索與優(yōu)化。三.利用PCR擴(kuò)增的方法,從CRISPR-CTLA-4-PD-1雙敲除質(zhì)粒中擴(kuò)增達(dá)到CTLA-4-PD-1片段,將此片段連接到腺病毒表達(dá)載體上,以嘗試通過構(gòu)建CRISPR-CTLA-4-PD-1腺病毒感染人原代淋巴細(xì)胞。四.利用構(gòu)建靶向CTLA-4和PD-1基因的CRISPR/RNP蛋白復(fù)合物,使用已經(jīng)優(yōu)化好的電穿孔條件將其電穿孔轉(zhuǎn)染到人原代淋巴細(xì)胞中,并觀測(cè)轉(zhuǎn)染后基因編輯的情況和改造后淋巴細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞系的殺... 

【文章來源】：廣東藥科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：155 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

pX458質(zhì)粒提取與酶切Figure2-1pX458plasmidextractionanddigestion

廣東藥科大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文M：1kb DNA Marker. 1: PCR 陰性組. 2、3：PD1-1s. 4、5：PD1-2s. 6、7：PD1-3s.8、9：CTLA4-1-1. 10、11：CTLA4-1-2. 12、13：CTLA4-2-1. 分子量單位：bp圖 2-2 gRNA 與 pX458 連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌后菌液 PCRFigure 2-2 PCR of bacterial cells after gRNA and pX458 were ligated into E.coli如圖 2-3 所示，經(jīng)過分析比對(duì)，可以看出構(gòu)建的六組 sgRNA： CTLA4-1-1,CTLA4-1-2, CTLA4-2-1，PD1-1s, PD1-2s, PD1-3s 已成功插入到 pX458 的酶切位點(diǎn)中，并且已轉(zhuǎn)入到 DH5α中。測(cè)序結(jié)果與最初設(shè)計(jì)的 gRNA 序列相同，確定所挑選的單菌落為陽性重組子。可進(jìn)行下一步的搖菌擴(kuò)大以及提取去內(nèi)毒素的質(zhì)粒。

廣東藥科大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文2.3.2.1 去內(nèi)毒素重組質(zhì)粒提取將測(cè)序驗(yàn)證正確連接的重組大腸桿菌擴(kuò)大搖菌，搖菌后用 Omega 去內(nèi)毒素小提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，以備后續(xù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞用。從圖 2-4 可以看出提取的質(zhì)粒主要為超螺旋結(jié)構(gòu)，有少量線性結(jié)構(gòu)，幾乎沒有檢測(cè)到開環(huán)結(jié)構(gòu)。

【參考文獻(xiàn)】：
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