本文關(guān)鍵詞：滇重樓SE、HMGR和FPS基因的克隆及原核表達(dá)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的克隆滇重樓甾體皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶鯊烯環(huán)氧酶(SE)基因、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)基因和法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因并進(jìn)行原核表達(dá)。并用Real-time PCR法檢測(cè)c DNA樣本中SE1基因、SE2基因、HMGR基因和FPS基因的相對(duì)含量。方法以昆明市梁王山采摘的滇重樓根莖為材料,提取其總RNA,再反轉(zhuǎn)錄為c DNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的c DNA為模板,根據(jù)Hi Seq2500 sequencing platform得到的滇重樓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的兩組SE基因、HMGR基因和FPS基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)特異性引物,克隆SE基因、HMGR基因和FPS基因,再將克隆得到的基因片段轉(zhuǎn)入到p EASY-T1 Simple Cloning Vector中,經(jīng)測(cè)序鑒定正確后,構(gòu)建表達(dá)載體,利用Art Media protein Expression/Amp+培養(yǎng)基進(jìn)行自動(dòng)誘導(dǎo)表達(dá),并用Real-time PCR法檢測(cè)c DNA樣本中SE1、SE2、HMGR和FPS基因相對(duì)含量。結(jié)果獲得了兩條滇重樓SE基因,將它們分別命名為SE1、SE2基因,全長(zhǎng)分別為1932bp、1828bp。SE1的ORF長(zhǎng)為1578bp,編碼525個(gè)氨基酸,SE2的ORF長(zhǎng)為1548bp,編碼515個(gè)氨基酸。熒光定量PCR結(jié)果顯示SE1基因在莖和葉中的表達(dá)與SE2基因相比較具有顯著差異,SE1的表達(dá)在葉中最為顯著。獲得了一條滇重樓HMGR基因,全長(zhǎng)1731bp,ORF為1593bp,編碼531個(gè)氨基酸。熒光定量PCR結(jié)果表明HMGR基因在根中的表達(dá)量高于莖和葉。獲得了一條滇重樓的FPS基因,全長(zhǎng)為1206bp,并且包含完整的ORF,大小為1050bp,編碼350個(gè)氨基酸。熒光定量PCR結(jié)果顯示,FPS基因在葉中的表達(dá)量較高。測(cè)序結(jié)果表明,原核表達(dá)載體p EASY-E1-SE、p EASY-E1-HMGR和p EASY-E1-FPS構(gòu)建成功。SDS-PAGE分析顯示,在BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中成功誘導(dǎo)表達(dá)了SE1、SE2、HMGR和FPS基因并獲得了相對(duì)應(yīng)的四種融合蛋白。結(jié)論SE1基因和SE2基因在滇重樓中具有不同的表達(dá)模式,且可能在滇重樓次生代謝產(chǎn)物的合成中起著不同的作用。HMGR基因在根中的高表達(dá)以及FPS基因在葉中的高表達(dá)等結(jié)果,為滇重樓功能基因表達(dá)分析研究及人工調(diào)控滇重樓有效成分的生物合成奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：滇重樓 SE HMGR FPS 基因克隆 原核表達(dá) 熒光定量 PCR
【學(xué)位授予單位】：云南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S567.239
【目錄】：

• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 縮略詞表11-13
• 引言13-15
• 第一章 滇重樓SE基因cDNA全長(zhǎng)的獲取及原核表達(dá)15-46
• 1 研究目的和意義15
• 2 材料、儀器和試劑15-16
• 2.1 材料15
• 2.2 儀器15-16
• 2.3 試劑16
• 3 實(shí)驗(yàn)方法16-23
• 3.1 滇重樓SE基因cDNA全長(zhǎng)的獲得16-21
• 3.1.1 滇重樓根的總RNA提取16-17
• 3.1.2 滇重樓SE基因cDNA的合成17-18
• 3.1.3 滇重樓SE基因的PCR擴(kuò)增18-19
• 3.1.4 滇重樓SE基因的克隆及載體構(gòu)建19-21
• 3.2 滇重樓SE基因的原核表達(dá)21-22
• 3.2.1 滇重樓SE基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定21
• 3.2.2 滇重樓SE基因原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)21
• 3.2.3 原核表達(dá)后總蛋白的提取21-22
• 3.3 滇重樓SE基因的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)22-23
• 3.3.1. 利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物22
• 3.3.2 滇重樓SE基因cDNA的獲得22
• 3.3.3 PCR反應(yīng)步驟22-23
• 4 結(jié)果與討論23-44
• 4.1 滇重樓SE基因cDNA全長(zhǎng)的獲得23-34
• 4.1.1 滇重樓根組織總RNA質(zhì)量檢測(cè)23-24
• 4.1.2 滇重樓SE基因的克隆與序列分析24-34
• 4.2 滇重樓SE基因的原核表達(dá)結(jié)果34-40
• 4.2.1 重組表達(dá)載體pEASY-E1-SE的構(gòu)建與鑒定結(jié)果34
• 4.2.2 重組表達(dá)載體pEASY-E1-SE的誘導(dǎo)表達(dá)34-40
• 4.3 滇重樓SE基因熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-44
• 5 討論44-46
• 第二章 滇重樓HMGR基因的cDNA全長(zhǎng)的獲取及原核表達(dá)46-63
• 1 研究目的和意義46
• 2 材料、儀器和試劑46-47
• 2.1 材料46-47
• 2.2 儀器47
• 2.3 試劑47
• 3 實(shí)驗(yàn)方法47-51
• 3.1 滇重樓HMGR基因cDNA全長(zhǎng)的獲得47-49
• 3.1.1 滇重樓根的總RNA提取與cDNA合成47
• 3.1.2 滇重樓HMGR基因 3’RACE實(shí)驗(yàn)47-49
• 3.1.3 滇重樓HMGR基因的克隆49
• 3.2 滇重樓HMGR基因的原核表達(dá)49-50
• 3.2.1 滇重樓HMGR基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定49-50
• 3.2.2 滇重樓HMGR基因原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)50
• 3.2.3 原核表達(dá)后總蛋白的提取50
• 3.3 滇重樓HMGR基因的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方法50-51
• 4 結(jié)果51-62
• 4.1 滇重樓HMGR基因cDNA全長(zhǎng)的獲得51-60
• 4.1.1 滇重樓根組織總RNA質(zhì)量檢測(cè)51
• 4.1.2 3’RACE實(shí)驗(yàn)PCR電泳與回收51-52
• 4.1.3 滇重樓HMGR基因的克隆52-60
• 4.2 滇重樓HMGR基因的原核表達(dá)結(jié)果60-61
• 4.2.1 重組表達(dá)載體pEASY-E1-HMGR的構(gòu)建與鑒定結(jié)果60
• 4.2.2 重組表達(dá)載體pEASY-E1-SE的誘導(dǎo)表達(dá)60-61
• 4.3 滇重樓HMGR基因熒光定量PCR結(jié)果61-62
• 5 討論62-63
• 第三章 滇重樓FPS基因cDNA全長(zhǎng)的獲取及原核表達(dá)63-77
• 1 研究目的和意義63
• 2 材料、儀器和試劑63-64
• 2.1 材料63
• 2.2 儀器63
• 2.3 試劑63-64
• 3 實(shí)驗(yàn)方法64-66
• 3.1 滇重樓FPS基因cDNA全長(zhǎng)的獲得64-65
• 3.1.1 滇重樓根的總RNA提取與cDNA合成64
• 3.1.2 滇重樓FPS基因的克隆與序列分析64-65
• 3.2 滇重樓FPS基因的原核表達(dá)65-66
• 3.2.1 滇重樓FPS基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定65
• 3.2.2 滇重樓FPS基因原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)65
• 3.2.3 原核表達(dá)后總蛋白的提取65-66
• 3.3 滇重樓FPS基因的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)方法66
• 4 結(jié)果66-76
• 4.1 滇重樓FPS基因cDNA全長(zhǎng)的獲得66-73
• 4.1.1 滇重樓根組織總RNA質(zhì)量檢測(cè)66
• 4.1.2 滇重樓FPS基因的克隆與序列分析66-73
• 4.2 滇重樓FPS基因的原核表達(dá)73-74
• 4.2.1 重組表達(dá)載體pEASY-E1-FPS的構(gòu)建與鑒定結(jié)果73
• 4.2.2 重組表達(dá)載體pEASY-E1-FPS的誘導(dǎo)表達(dá)73-74
• 4.3 滇重樓FPS基因的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)74-76
• 5 討論76-77
• 參考文獻(xiàn)77-80
• 綜述80-98
• 藥用植物中鯊烯環(huán)氧酶基因的研究進(jìn)展80-90
• 參考文獻(xiàn)88-90
• 滇重樓SE基因、HMGR基因和FPS基因研究進(jìn)展90-98
• 參考文獻(xiàn)95-98
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章98-99
• 附錄99-105
• 致謝105

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7 王進(jìn)波;滇重樓鯊烯合酶和環(huán)阿屯醇合酶的基因克隆與序列分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

8 王羽;滇重樓抗腫瘤活性成分的研究[D];天津大學(xué);2007年

9 徐文娟;滇重樓種子發(fā)育與種子休眠解除機(jī)理研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

10 李靜;滇重樓內(nèi)生真菌及其抗菌活性檢測(cè)和甾體化合物分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

  本文關(guān)鍵詞：滇重樓SE、HMGR和FPS基因的克隆及原核表達(dá)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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