Pi39是位于水稻第12染色體上的稻瘟病新抗性基因,為了明確其功能,本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建候選基因的敲除載體。通過對候選基因序列分析,將合成的靶位點(diǎn)序列插入入門載體p ENTR-sg RNA,再與表達(dá)載體Cas9發(fā)生重組。本研究首先在候選基因的第一個(gè)外顯子區(qū)域找到了2個(gè)帶有PAM序列的靶位點(diǎn),將2個(gè)目的小片段依次克隆到p ENTR-sg RNA載體上。通過菌落PCR檢測及測序,結(jié)果表明目的小片段插入位置正確。將入門載體與表達(dá)載體進(jìn)行重組反應(yīng)后,陽性克隆經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒DNA酶切鑒定并測序,結(jié)果表明重組載體構(gòu)建成功。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建敲除載體操作簡單,耗時(shí)短,為進(jìn)一步開展Pi39候選基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2016年06期

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

表達(dá)載體pUbi-Cas9和入門載體pENTR-sgRNA

的引物列表注：引物1和2，3和4互補(bǔ)配對，可形成兩對寡核苷酸雙鏈。引物5號可作為正向反應(yīng)的測序，此外，分別與2號，4號搭配用于PCR擴(kuò)增。引物序列中下劃線部分為酶切位點(diǎn)�？寺∶麨閜ENTR-39C1。2.3第二個(gè)編輯位點(diǎn)的插入及陽性克隆鑒定pENTR-39C1克隆鑒定成功后，插入第二個(gè)寡核苷酸雙鏈（39CkdBsaⅠF/R二聚體），轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌落PCR檢測，擴(kuò)增引物為U6F和39CkdBsaⅠR，擴(kuò)增片段大小為721bp（圖3）。測序結(jié)果表明片段插入正確，陽性克隆命名為pENTR-39C2。M：DL2000；1：pENTR-sgRNA空載體；2~7：6個(gè)單克隆圖2pENTR-39C1菌落PCR鑒定圖M：DL2000；1：pENTR-sgRNA空載體；2~9：8個(gè)單克隆圖3pENTR-39C2菌落PCR鑒定圖·93·

正向反應(yīng)的測序，此外，分別與2號，4號搭配用于PCR擴(kuò)增。引物序列中下劃線部分為酶切位點(diǎn)。克隆命名為pENTR-39C1。2.3第二個(gè)編輯位點(diǎn)的插入及陽性克隆鑒定pENTR-39C1克隆鑒定成功后，插入第二個(gè)寡核苷酸雙鏈（39CkdBsaⅠF/R二聚體），轉(zhuǎn)化后進(jìn)行菌落PCR檢測，擴(kuò)增引物為U6F和39CkdBsaⅠR，擴(kuò)增片段大小為721bp（圖3）。測序結(jié)果表明片段插入正確，陽性克隆命名為pENTR-39C2。M：DL2000；1：pENTR-sgRNA空載體；2~7：6個(gè)單克隆圖2pENTR-39C1菌落PCR鑒定圖M：DL2000；1：pENTR-sgRNA空載體；2~9：8個(gè)單克隆圖3pENTR-39C2菌落PCR鑒定圖·93·

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)基因組編輯的研究進(jìn)展[J]. 劉志國.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2014(10)
[2]稻瘟病抗性基因的克隆及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 張佩勝,趙春德,余寧,張迎信,劉群恩.  中國稻米. 2014(05)



本文編號：2933706