本文關(guān)鍵詞：太子參皂苷合成關(guān)鍵酶HMGR基因的克隆與轉(zhuǎn)化煙草研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：太子參系石竹科草本植物異葉假繁縷的塊根,在臨床上用于多種經(jīng)典補益配方,亦是多種中成藥的重要成分之一,有抗疲勞、抗應(yīng)激、增強免疫力等藥理作用,是福建省最具特色的大宗道地藥材之一。皂苷(Saponin)是皂苷或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷,是植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物,其主要功能是參與植物防御反應(yīng),以抵御病原物和草食動物的危害。太子參皂苷是太子參中主要藥效成分,具有抗疲勞、耐缺氧、耐低溫作用,能增加免疫器官的重量,并能激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)是植物皂苷主要的合成途徑——甲羥戊酸途徑(MVA途徑)中催化HMG-CoA還原形成甲羥戊酸(MVA)限速酶,該反應(yīng)不可逆,被認為是MVA途徑的第一個限速反應(yīng),具有重要意義。通過太子參HMGR基因編碼序列的克隆和功能研究有助于理解太子參皂苷的合成與代謝相關(guān)研究,提高其皂苷含量,創(chuàng)造良好經(jīng)濟效益。目前對太子參的研究主要集中于栽培和常規(guī)育種方面,相關(guān)的分子生物學(xué)研究不夠深入,特別是關(guān)于其活性成分分子調(diào)控機制的研究目前還是空白。本研究以太子參拓參1號為植物材料,通過RACE技術(shù)克隆HMGR全長cDNA序列,構(gòu)建其重組表達載體,轉(zhuǎn)化煙草K326品種中,并對轉(zhuǎn)基因植株的HMGR酶活及總皂苷含量測定與分析。主要研究結(jié)果如下：(1)通過提取太子參總RNA,利用RACE和RT-PCR等技術(shù)對太子參皂苷合成途徑中的關(guān)鍵酶基因HMGR進行分離鑒定,獲得到一條長度2137bp的序列,該序列含一個1674 bp的可譯閱讀框,編碼557個氨基酸殘基,相對分子質(zhì)量為59.327 kDa,等電點(pI)值為7.58。經(jīng)相似性分析,源于太子參HMGR的氨基酸序列與人參HMGR的一致性為76.7%,與擬南芥HMGR的一致性為77.7%,與刺五加HMGR、蘿卜HMGR的一致性為77.1%,推測獲得的序列為太子參HMGR侯選基因。(2)將獲得的HMGR基因ORF序列與真核表達載體pRi 101-AN進行連接,獲得重組質(zhì)粒pRi-HMGR,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法浸染煙草K326,經(jīng)PCR檢測,共獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株30株,轉(zhuǎn)化率為93.75%。(3)利用微波處理等方法提取轉(zhuǎn)HMGR煙草與非轉(zhuǎn)基因植株培養(yǎng)基中的總皂苷,通過香草醛-高氯酸反應(yīng)體系法測定皂苷含量,結(jié)果表明,種植轉(zhuǎn)HMGR煙草分泌到培養(yǎng)基中的皂苷類物質(zhì)的含量明顯高于非轉(zhuǎn)基因煙草,最高達16.64%,約為非轉(zhuǎn)基因植株的兩倍,表明外源HMGR在煙草中得到表達,并提高了煙草總?cè)频暮俊?4)論文對HMGR酶活測定體系進行了優(yōu)化,并對轉(zhuǎn)HMGR煙草與非轉(zhuǎn)基因煙草植株的HMGR酶活進行了測定,結(jié)果表明,HMGR酶的最適溫度為26℃,最適pH為6.0,且樣品在紫外光下處理45 min仍可保持一定酶活性。轉(zhuǎn)HMGR煙草的HMGR酶活力明顯高于非轉(zhuǎn)基因煙草,轉(zhuǎn)HMGR煙草轉(zhuǎn)錄表達的酶活力高達0.036單位,是非轉(zhuǎn)基因煙草對照的三倍。
【關(guān)鍵詞】：太子參 基因克隆 皂苷 MVA HMGR
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 1 文獻綜述11-21
• 1.1 太子參概述11
• 1.2 太子參的主要活性成分11-14
• 1.2.1 氨基酸11-12
• 1.2.2 多糖12-14
• 1.2.3 微量元素14
• 1.3 苷類14-18
• 1.3.1 皂苷的功效14
• 1.3.2 合成途徑14-15
• 1.3.3 苷類合成關(guān)鍵酶15-17
• 1.3.4 皂苷研究17-18
• 1.4 太子參成分研究方法18-19
• 1.4.1 質(zhì)譜法18
• 1.4.2 色譜法18-19
• 1.5 太子參其他研究及展望19-20
• 1.6 研究目的及意義20-21
• 2 材料與方法21-29
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 植物材料、菌株及質(zhì)粒21
• 2.1.2 藥品與試劑21
• 2.1.3 儀器21
• 2.1.4 培養(yǎng)基21-22
• 2.1.5 溶液配置22-23
• 2.2 方法23-29
• 2.2.1 太子參HMGR全長cDNA的分離及表達載體構(gòu)建23-25
• 2.2.2 轉(zhuǎn)HMGR煙草的培育與檢測25-26
• 2.2.3 轉(zhuǎn)HMGR煙草總?cè)铺崛∨c含量測定26-27
• 2.2.4 轉(zhuǎn)HMGR煙草中HMGR酶活性分析27-29
• 3 結(jié)果與分析29-47
• 3.1 太子參HMGR基因的克隆與表達載體構(gòu)建29-34
• 3.1.1 太子參總RNA的提取與檢測29
• 3.1.2 太子參HMGR基因3’端和5’端的PCR擴增29-30
• 3.1.3 太子參HMGR基因生物信息學(xué)分析30-33
• 3.1.4 重組表達載體的構(gòu)建與檢測33-34
• 3.2 轉(zhuǎn)HMGR煙草培育與檢測34-37
• 3.2.1 轉(zhuǎn)HMGR煙草的培育34-35
• 3.2.2 轉(zhuǎn)HMGR煙草PCR鑒定35-37
• 3.2.3 轉(zhuǎn)HMGR煙草RT-PCR鑒定37
• 3.3 轉(zhuǎn)HMGR煙草總?cè)铺崛y定37-41
• 3.3.1 Rb1標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制37-38
• 3.3.2 煙草總?cè)坪繉Ρ?/span>38-41
• 3.4 HMGR酶活性檢測分析41-47
• 3.4.1 蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖41-42
• 3.4.2 HMGR酶活性分析與物理條件的影響42-47
• 4 討論47-49
• 結(jié)論49-51
• 參考文獻51-59
• 附錄Ⅰ 實驗縮寫中英文對照59-60
• 附錄Ⅱ 實驗部分所用培養(yǎng)基配方60-61
• 附錄Ⅲ 實驗部分圖示61-66
• 致謝66

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 鄭鵬;化文平;王U喼，

本文編號：292179