發(fā)布時(shí)間：2020-12-06 00:26

　　仿刺參具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,是我國(guó)沿海最重要的養(yǎng)殖品種之一。然而,近年來(lái),各個(gè)年齡段的仿刺參病害的大規(guī)模爆發(fā)對(duì)其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重威脅,深入研究刺參的抗病機(jī)制和有效防治途徑已經(jīng)成為當(dāng)前仿刺參養(yǎng)殖基礎(chǔ)研究中的熱點(diǎn)。本文以仿刺參[Apostichopus japonicus（Slenka）]為研究對(duì)象,通過(guò)RACE克隆技術(shù)獲得了仿刺參類硫氧還蛋白（AjTRX）基因的cDNA序列,運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)研究了其在不同組織和燦爛弧菌（Vibrio splendidus）刺激后的表達(dá)情況;此外,參照基因工程技術(shù)表達(dá)和純化出了AjTRX基因的重組蛋白,并對(duì)其的活性進(jìn)行了驗(yàn)證;最后,通過(guò)RNA干擾技術(shù)研究了AjTRX基因與活性氧（ROS）生成量之間的關(guān)系。主要研究結(jié)果如下:1.本實(shí)驗(yàn)結(jié)合轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的篩查結(jié)果和RACE克隆技術(shù),首次得到了仿刺參AjTRX基因的cDNA全長(zhǎng)。AjTRX基因的cDNA全長(zhǎng)1870 bp,由一個(gè)882 bp的編碼293個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框,一個(gè)101 bp的5’非編碼區(qū)和一個(gè)887 bp的3’非編碼區(qū)組成。AjTRX基因預(yù)測(cè)的氨基酸的分子量和等電點(diǎn)分別是32.3 k... 

【文章來(lái)源】：大連海洋大學(xué)遼寧省

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 仿刺參的養(yǎng)殖現(xiàn)狀和病害研究
    1.2 硫氧還蛋白（TRX）系統(tǒng)的研究
    1.3 抗氧化系統(tǒng)的研究進(jìn)展
        1.3.1 超氧化物歧化酶（SOD）
        1.3.2 過(guò)氧化氫酶（CAT）
        1.3.3 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）
        1.3.4 硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（TPX）
    1.4 仿刺參的先天性免疫系統(tǒng)
    1.5 本研究的目的及意義
第二章 仿刺參AJTRX基因的克隆與時(shí)空表達(dá)分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 細(xì)菌培養(yǎng)及樣品收集
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑
        2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑的配制
        2.1.5 引物設(shè)計(jì)
        2.1.6 總RNA的提取
        2.1.7 AjTRX基因第一鏈cDNA鏈的合成
        2.1.8 3 ’RACE和5’RACE
        2.1.9 PCR產(chǎn)物的回收與純化
        2.1.10 AjTRX基因的克隆與測(cè)序
        2.1.11 序列分析
        2.1.12 AjTRX基因cDNA的合成
        2.1.13 AjTRX基因熒光定量分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 總RNA提取結(jié)果
        2.2.2 AjTRX基因的RACE擴(kuò)增結(jié)果
        2.2.3 AjTRX基因的菌落PCR鑒定
        2.2.4 AjTRX基因cDNA的全長(zhǎng)及其序列分析
        2.2.5 AjTRX氨基酸序列的同源性分析和進(jìn)化分析
        2.2.6 AjTRX基因組織分布
        2.2.7 燦爛弧菌刺激后體腔細(xì)胞中AjTRX基因的表達(dá)情況
    2.3 討論
第三章 仿刺參類硫氧還蛋白的活性分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 重組蛋白引物的設(shè)計(jì)
        3.1.4 AjTRX重組蛋白（rAJTRX）的表達(dá)和純化
        3.1.5 rAJTRX的SDS-PAGE,復(fù)性和濃度測(cè)定
        3.1.6 rAJTRX的活性檢測(cè)
        3.1.7 統(tǒng)計(jì)分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 SDS-PAGE結(jié)果分析
        3.2.2 抗氧化性結(jié)果說(shuō)明
    3.3 討論
第四章 仿刺參AJTRX基因的功能驗(yàn)證
    4.1 材料與方法
        4.1.1 主要試劑
        4.1.2 仿刺參體腔細(xì)胞的原代培養(yǎng)
        4.1.3 體外及體內(nèi)miRNA干擾
        4.1.4 干擾效率分析
        4.1.5 ROS生成量的測(cè)定
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 總RNA的提取
        4.2.2 AjTRX基因體外干擾效率的分析
        4.2.3 AjTRX基因體內(nèi)干擾效率的分析
        4.2.4 AjTRX基因體外干擾對(duì)ROS生成量的影響
        4.2.5 AjTRX基因體內(nèi)干擾對(duì)ROS生成量的影響
    4.3 討論
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]四種不同添加物對(duì)仿刺參非特異性免疫力和腸道免疫基因Aj-p105、Aj-p50、Aj-rel和Aj-lys mRNA表達(dá)的影響[J]. 陽(yáng)鋼,田相利,董雙林,彭墨,王棟棟,張凱.  水產(chǎn)學(xué)報(bào). 2015(05)
[2]黃河三角洲地區(qū)仿刺參養(yǎng)殖池中混養(yǎng)日本對(duì)蝦的試驗(yàn)[J]. 左明,張士華,隋凱港,劉志國(guó),趙磊.  水產(chǎn)科技情報(bào). 2014(05)
[3]刺參密度對(duì)鮑參混養(yǎng)效果的影響[J]. 王云.  福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2014(07)
[4]復(fù)方中草藥對(duì)大菱鲆非特異性免疫力的影響[J]. 李華,張?zhí)?李強(qiáng).  大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào). 2013(02)
[5]24-表油菜素內(nèi)酯對(duì)低溫脅迫下葡萄幼苗抗氧化系統(tǒng)及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響[J]. 惠竹梅,王智真,胡勇,鄧敏敏,張振文.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2013(05)
[6]刺參龍須菜混養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)菌數(shù)量與群落組成[J]. 高菲,孫慧玲,王肖君,譚杰,燕敬平.  漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展. 2012(04)
[7]西施舌稚貝與仿刺參幼參混養(yǎng)的研究[J]. 李文波,高如承,潘輝,陳志.  福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2012(04)
[8]飼料中添加益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)非特異免疫基因表達(dá)量和抗病力的影響[J]. 孫艷,劉飛,宋曉玲,麥康森,李玉宏,黃倢.  海洋與湖沼. 2012(04)
[9]全營(yíng)養(yǎng)破壁酵母對(duì)仿刺參非特異性免疫及腸道菌群的影響[J]. 宮魁,王寶杰,劉梅,蔣克勇,孫姝娟,王雷,范瑞用,張連潤(rùn),張連水.  中國(guó)水產(chǎn)科學(xué). 2012(04)
[10]飼料中添加硒酵母和維生素E對(duì)刺參生長(zhǎng)、免疫力及抗病力的影響[J]. 張琴,麥康森,張文兵,馬洪明,艾慶輝,徐瑋,劉付志國(guó).  動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào). 2011(10)

博士論文
[1]松江鱸（Trachidermus fasciatus）抗氧化相關(guān)基因的克隆、表達(dá)與功能分析[D]. 劉瑩瑩.山東大學(xué) 2012
[2]櫛孔扇貝抗氧化酶基因的克隆與表達(dá)分析[D]. 倪多嬌.中國(guó)科學(xué)院研究生院（海洋研究所） 2007

碩士論文
[1]擬穴青蟹硫氧還蛋白系統(tǒng)及抗氧化相關(guān)基因的研究分析[D]. 胡敬環(huán).上海海洋大學(xué) 2014



本文編號(hào)：2900363