仿刺參具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值,是我國沿海最重要的養(yǎng)殖品種之一。然而,近年來,各個年齡段的仿刺參病害的大規(guī)模爆發(fā)對其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了嚴重威脅,深入研究刺參的抗病機制和有效防治途徑已經(jīng)成為當前仿刺參養(yǎng)殖基礎研究中的熱點。本文以仿刺參[Apostichopus japonicus（Slenka）]為研究對象,通過RACE克隆技術獲得了仿刺參類硫氧還蛋白（AjTRX）基因的cDNA序列,運用熒光定量PCR技術研究了其在不同組織和燦爛弧菌（Vibrio splendidus）刺激后的表達情況;此外,參照基因工程技術表達和純化出了AjTRX基因的重組蛋白,并對其的活性進行了驗證;最后,通過RNA干擾技術研究了AjTRX基因與活性氧（ROS）生成量之間的關系。主要研究結果如下:1.本實驗結合轉錄組文庫的篩查結果和RACE克隆技術,首次得到了仿刺參AjTRX基因的cDNA全長。AjTRX基因的cDNA全長1870 bp,由一個882 bp的編碼293個氨基酸的開放閱讀框,一個101 bp的5’非編碼區(qū)和一個887 bp的3’非編碼區(qū)組成。AjTRX基因預測的氨基酸的分子量和等電點分別是32.3 k... 

【文章來源】：大連海洋大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    1.1 仿刺參的養(yǎng)殖現(xiàn)狀和病害研究
    1.2 硫氧還蛋白（TRX）系統(tǒng)的研究
    1.3 抗氧化系統(tǒng)的研究進展
        1.3.1 超氧化物歧化酶（SOD）
        1.3.2 過氧化氫酶（CAT）
        1.3.3 谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）
        1.3.4 硫氧還蛋白過氧化物酶（TPX）
    1.4 仿刺參的先天性免疫系統(tǒng)
    1.5 本研究的目的及意義
第二章 仿刺參AJTRX基因的克隆與時空表達分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 細菌培養(yǎng)及樣品收集
        2.1.3 實驗主要試劑
        2.1.4 主要實驗試劑的配制
        2.1.5 引物設計
        2.1.6 總RNA的提取
        2.1.7 AjTRX基因第一鏈cDNA鏈的合成
        2.1.8 3 ’RACE和5’RACE
        2.1.9 PCR產(chǎn)物的回收與純化
        2.1.10 AjTRX基因的克隆與測序
        2.1.11 序列分析
        2.1.12 AjTRX基因cDNA的合成
        2.1.13 AjTRX基因熒光定量分析
    2.2 結果
        2.2.1 總RNA提取結果
        2.2.2 AjTRX基因的RACE擴增結果
        2.2.3 AjTRX基因的菌落PCR鑒定
        2.2.4 AjTRX基因cDNA的全長及其序列分析
        2.2.5 AjTRX氨基酸序列的同源性分析和進化分析
        2.2.6 AjTRX基因組織分布
        2.2.7 燦爛弧菌刺激后體腔細胞中AjTRX基因的表達情況
    2.3 討論
第三章 仿刺參類硫氧還蛋白的活性分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 重組蛋白引物的設計
        3.1.4 AjTRX重組蛋白（rAJTRX）的表達和純化
        3.1.5 rAJTRX的SDS-PAGE,復性和濃度測定
        3.1.6 rAJTRX的活性檢測
        3.1.7 統(tǒng)計分析
    3.2 結果
        3.2.1 SDS-PAGE結果分析
        3.2.2 抗氧化性結果說明
    3.3 討論
第四章 仿刺參AJTRX基因的功能驗證
    4.1 材料與方法
        4.1.1 主要試劑
        4.1.2 仿刺參體腔細胞的原代培養(yǎng)
        4.1.3 體外及體內(nèi)miRNA干擾
        4.1.4 干擾效率分析
        4.1.5 ROS生成量的測定
    4.2 結果
        4.2.1 總RNA的提取
        4.2.2 AjTRX基因體外干擾效率的分析
        4.2.3 AjTRX基因體內(nèi)干擾效率的分析
        4.2.4 AjTRX基因體外干擾對ROS生成量的影響
        4.2.5 AjTRX基因體內(nèi)干擾對ROS生成量的影響
    4.3 討論
參考文獻
攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]松江鱸（Trachidermus fasciatus）抗氧化相關基因的克隆、表達與功能分析[D]. 劉瑩瑩.山東大學 2012
[2]櫛孔扇貝抗氧化酶基因的克隆與表達分析[D]. 倪多嬌.中國科學院研究生院（海洋研究所） 2007

碩士論文
[1]擬穴青蟹硫氧還蛋白系統(tǒng)及抗氧化相關基因的研究分析[D]. 胡敬環(huán).上海海洋大學 2014



本文編號：2900363